为0. 02~0. lmmol/L。所述的不对称还 原反应较佳的是在振荡或搅拌条件下进行。所述的不对称还原反应的温度较佳地为20~ 40°C，更佳地为25~35°C。所述的不对称还原反应的时间较佳地以前手性羰基化合物的含 量在反应溶液中低于5 %为准。不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提 取手性羟基产物。
[0042] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0043] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0044] 本发明的积极进步效果在于：本发明针对已经报道的反应收率低、原料成本昂贵、 反应不完全、对应选择性不高等问题，提供了一种新的醛酮还原酶突变体及利用重组醛酮 还原酶突变体或其冻干粉进行不对称还原的方法。在催化浓度高达l〇〇〇g/L的底物时，产 物的光学纯度仍高达98%以上，且不需要额外添加昂贵的辅酶。相对于其它不对称还原 制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，并且具有产物光学纯度高、反应条件温 和、对环境友好、操作简便、易于工业放大的优点，因此具有很好的工业应用前景。
【附图说明】
[0045] 图1是醛酮还原酶基因 PCR产物的琼脂凝胶电泳图。泳道M :DNA ladder ;泳道1 : KRED 的 PCR。
[0046] 图2是醛酮还原酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。泳道Μ :蛋白的分子量标准； 泳道1 :KRED的蛋白上清液
【具体实施方式】
[0047] 下面通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未 注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0048] E. coli BL21(DE3)感受态细胞购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
[0049] 实施例1随机突变
[0050] 以来源于中国专利申请201410541899. 8的醛酮还原酶基因 BYKY-KRED(其核苷 酸序列如本申请SEQ ID N0:1所示）为模板，以SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6为引物，对 BYKY-KRED进行随机突变。随机突变PCR程序如下：10XMutazyme II reaction buffer 5yL，40mM dNTP mix lyL(终浓度200以]?)，正向引物和反向引物各250即/^1^]\1此&271116 II DNA聚合酶2. 5U/ μ L，DNA模板lng，ddH20补足50 μ L。PCR扩增步骤为：（1) 95°C，预变 性2min ;(2)95°C，变性30s ;(3)56°C退火30s ;⑷72°C延伸lmin ;步骤⑵~⑷重复30 次；（5) 72°C继续延伸10min，冷却至4°C。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒回收800~900bp区间的目标条带（见图1)，获得完整的0RF序列，经DNA 测序，全长843bp。PCR产物切胶回收后，用Ndel/HindllI酶切后连接到pET21原核表达载 体，并转化到E. coli BL21 (DE3)感受态细菌，涂布到含有氨苄青霉素（50 μ g/mL)的LB平 板培养，得到突变体文库，文库效价大于l〇〇〇〇cfu。
[0051] 实施例2醛酮还原酶基因分离
[0052] 挑选阳性菌落，加入到含有lmL LB培养基（含100 μ g/mL氨苄西林）的深孔96孔 板培养，即得到BYKY-KRED突变体基因工程大肠杆菌，接种到100mL液体LB培养基中进行 培养。过夜培养物转入1L新鲜的LB液体培养基，培养到0D 6。。达0. 6~0. 8,加入IPTG至 终浓度为100 μ Μ诱导重组蛋白表达，降温至30°C继续培养24小时。5000rpm离心收集菌 体，用0. 2M磷酸钠缓冲液（pH 7. 0)洗一次，菌体重悬于500 μ L含有lmg/mL溶菌酶和1U/ mL Benzonase核酸酶的PBS裂解缓冲液（pH 7. 2)中，-80°C冻融3次以破菌，lOOOOrpm离 心lOmin，取粗酶液上清50 μ L，加入一个新的96孔板，加入ImM底物、0. 2mM NADPH，总体积 200 μ L，340nm下用酶标仪检测吸光度变化。5min内吸光度变化最大的菌落即为酶活最高， 提取质粒并测序，读码框序列见SEQ ID N0:3,编码的氨基酸序列为SEQ ID N0:4。
[0053] 实施例3高密度发酵
[0054] 将按照实施例2获得的BYKY-KRED突变体基因工程大肠杆菌接种于装有200mL LB培养基的1L摇瓶中，于37°C，180~220rpm培养10~16h。将上述培养好的种子培养 液按10% (v/V)的比例接种于3L上罐发酵培养基（M9培养基，含葡萄糖4g/L、磷酸氢二 钠12. 8g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化铵lg/L、硫酸钠0. 5g/L、氯化钙0. 0152g/L、六水氯化镁 0· 41g/L)中，在20~30°C，300~800rpm，空气流量2~6L/min的条件下培养。培养6~ 10h后，以5~20mL/h的速率流加含50 %甘油的补料培养基，持续至发酵结束。流加补料培 养基数小时至〇D6。。达到20~40时，添加0. 1~ImM IPTG开始诱导。诱导10~20h后，放 罐，5000rpm离心收集菌体。将菌体用5倍体积的PBS (pH7. 2)悬浮，高压均质机破碎菌体， 均质后的全菌裂解液可以作为粗酶液用于实施例4中的反应；亦可于lOOOOrpm离心30min 收集上清液，冻干机冻干得到冻干粉。
[0055] 实施例4前手性羰基底物的不对称还原反应（2%底物投料）
[0056] 20g表1中的前手性羰基底物溶于200mL水，用1M的NaOH调pH为约6. 0,加入酶 冻干粉2g，加入500mL水，加入葡萄糖7g和葡萄糖脱氢酶500U (购自sigma)，0.1 mM NADP+， 30°C搅拌反应16小时，用1M的NaOH水溶液控制反应pH在6. 5~7. 5之间，TLC检测反 应进程。反应结束后调pH 9.0,等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥， 减压旋干溶剂得到产物，测定光学纯度，纯度95. 0~97. 0 %，摩尔收率88~92%，产物为 2S, 3R-异构体，e. e.值 >99 %，d. e.值 >99 %。
[0057] 表1醛酮还原酶催化前手性羰基化合物发生不对称还原反应的结果
[0058]
[0059] 实施例5前手性羰基底物的不对称还原反应（2%底物投料）
[0060] 20g表2中前手性羰基底物溶于200mL水，用1M的NaOH调pH为约6. 0,加入200mL 的粗酶液和500mL水，20mL的异丙醇，pH约为8. 0, 30°C搅拌反应16小时，用1M的NaOH水 溶液控制反应pH在6. 5~7. 5之间，TLC检测反应进程。反应结束后调pH为约9. 0,等体积 乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得到产物，测定光学纯度， 纯度95. 0~97. 0%，摩尔收率88~92%，产物为2S，3R-异构体，e. e.值>99%，d. e.值 >99 % 〇
[0061] 表2醛酮还原酶催化前手性羰基化合物发生不对称还原反应的结果
[0062]
[0063]
[0064] 实施例6前手性羰基底物的不对称还原反应（lOOg/L投料）
[0065] 500g 2-苯甲酰胺甲基-3-氧代丁酸甲酯溶于1L7K，用1M的NaOH调pH为约7. 0， 加入全菌裂解液1L，加入3L水，加入0.4L异丙醇，0.1 mM NADP+，30°C搅拌反应16小时， 用1M NaOH控制反应pH在6. 5~7. 5之间，TLC检测反应进程。反应结束