分泌抗马铃薯s病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗马铃薯S病毒单克隆抗体杂交瘤 细胞株及其单抗的应用。
【背景技术】
[0002] 马铃薯S病毒(Potato virus S，PVS)也称作马铃薯潜隐病毒，是危害马铃薯的主 要病毒之一，该病毒属于乙型线型病毒科（Betaflexiviridae)麝香石竹潜隐病毒属 (Carlavirus)的成员。PVS在1948年首次报道于荷兰，随后在世界各马铃薯种植地区皆有报 道，且其分布十分广泛。目前在我国北方的内蒙古、黑龙江、辽宁、河北、山东、青海以及南方 的广西、湖南、四川、浙江、福建、贵州等地均被发现，为给马铃薯的生产造成了严重的损失。 PVS在大多数马铃薯品种上可引起叶脉颜色变深、叶片粗缩、叶尖下卷、叶色变浅;有的马铃 薯品种感病后产生轻度斑驳、脉带;有的品种感病后期变成青铜色，严重皱缩，叶面产生小 的坏死斑，甚至落叶。研究发现该病毒可以通过汁液接触和蚜虫介体传播到茄科和藜科植 物上，且该病毒常常与其他病毒复合侵染马铃薯造成更为严重的危害。PVS的基因组全长 8.4-8.5kb，包含六个开放阅读框(0RF)，其中0RF 5编码一个34kDa的外壳蛋白（CP)。通过电 镜观察纯化的病毒粒子发现该病毒为直径为l〇_15nm，长约610_700nm的弯曲线状病毒。
[0003] 为了调查我国马铃薯上PVS的发病情况、强化我国马铃薯S病毒病检测和诊断技术 及科学指导防控，急需建立检测PVS经济、高通量的检测技术。目前，对PVS的检测和诊断多 采用低效率的指示植物、电镜观察、RT-PCR等方法进行小样本检测。本发明以纯化的PVS病 毒粒子作为抗原通过杂交瘤技术制备了 1株分泌抗PVS的特异性单抗的杂交瘤细胞株，以分 泌的单抗为核心建立检测PVS的高通量的血清学方法及试剂盒，从而为我国马铃薯S病毒的 检测和诊断、流行病学的调查、无毒种薯的生产、病毒基因组功能的分析及其科学防控体系 的建立提供物质和技术支持。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗马铃薯S病毒单抗的杂交 瘤细胞株及其单抗应用。
[0005] 分泌抗马铃薯S病毒单抗的杂交瘤细胞株16C10,它能分泌抗马铃薯S病毒的特异 性单抗，杂交瘤细胞株16C10于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏号为CGMCC No. 12002。
[0006] -种所述的杂交瘤细胞株分泌的抗马铃薯S病毒单抗，抗马铃薯S病毒单抗腹水间 接ELISA效价达10- 7,抗体类型及亚类为IgGl、kappa轻链，该单抗与马铃薯S病毒34KDa的外 壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现单抗检测感染PVS病 叶的灵敏度分别达到1:81 920和1:10 240倍稀释(w/v，g/mL)。
[0007] 抗马铃薯S病毒单抗能与马铃薯S病毒有特异性反应，而不与马铃薯A病毒、马铃薯 X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒和健康的马铃薯叶片粗提液反应。
[0008] 抗马铃薯S病毒单抗在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检 测方法及免疫学试剂盒。
[0009] 本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株分泌大量抗马铃 薯S病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的ACP-ELISA、dot-ELISA和Tissue blot-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏地检测马铃薯S病 毒;2)利用本发明所制备的单克隆抗体检测马铃薯S病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪 等设备;3)利用本发明所制备的单克隆抗体可有效地用于田间马铃薯S病毒的检测和诊断， 也可用于该病毒病的流行病学调查、病毒基因组功能分析、脱毒种薯生产、抗性育种、科学 防控等方面。
【附图说明】
[0010] 图1 dot-ELISA方法检测PVS的特异性分析；
[0011] 图2 dot-ELISA方法检测PVS的灵敏度分析；
[0012] 图3 dot-ELISA田间检测PVS代表性结果；
[0013]图4 RT-PCR对田间疑似发病马铃薯样品检测结果；
[0014] 图5 Tissue blot-ELISA田间检测PVS代表性结果。
[0015] 生物保藏
[0016] 杂交瘤细胞株16C10于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCC No.12002。
【具体实施方式】
[0017] 分泌抗马铃薯S病毒单抗的杂交瘤细胞株16C10于2016年1月7日保藏于中国科学 院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 12002,它能分泌抗马铃薯S病毒的单抗。
[0018] -种所述的杂交瘤细胞株分泌的抗马铃薯S病毒单抗，抗马铃薯S病毒单抗腹水间 接ELISA效价达1〇Λ抗体类型及亚类为IgGl、kappa轻链，该单抗能与马铃薯S病毒34KDa的 外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现单抗检测感染PVS 病叶的灵敏度分别达到1:81 920和1:10 240倍稀释(w/v，g/mL)。
[0019] 抗马铃薯S病毒单抗能与马铃薯S病毒有特异性反应，而不与马铃薯A病毒、马铃薯 X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒和健康的马铃薯叶片粗提液反应。
[0020] 抗马铃薯S病毒单抗在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检 测方法和免疫学试剂盒。
[0021] 本发明提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗马铃薯S病毒单抗，且该细胞株分泌的 单抗特异性强、效价高、稳定性好、灵敏度高。以该单抗为核心建立检测PVS的高通量的血清 学方法可成功应用于田间PVS的检测，从而为我国马铃薯S病毒病检测和诊断、脱毒种薯的 生产、科学防控提供物质和技术支持。
[0022]下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
[0023] 一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备
[0024] 1.免疫原及检测抗原的制备
[0025] 用下面的操作步骤提纯病毒粒子：
[0026] 1)将组织匀浆器在冰上预冷；
[0027] 2)称取马铃薯组织200g，每100g组织加入200mL 0.5M磷酸盐缓冲液即PB缓冲液 (含0.01M Na-EDTA和0.1 %巯基乙醇，pH 7.5)，在组织匀浆器中匀浆5-10min使马铃薯组织 充分匀浆，用双层棉纱布过滤匀浆液，滤液6 OOOrpm离心20min去除植物残渣；
[0028] 3)所得的上清液在搅拌中加至终浓度为2.5%Triton X-100、4%PEG(分子量为6 000)和0.1M NaCl，然后4°C搅拌4h以上；
[0029] 4)11 OOOrpm 离心 15min 去上清；
[0030] 5)用pH 7.5的0.5M PB(含0.01M MgC12和0.5M脲)将沉淀充分悬浮，6 OOOrpm离心 15min后将上清收集于烧杯中于4°C放置，沉淀再悬浮、离心，重复3次；
[0031 ] 6)将上述离心上清液合并，33 OOOrpm超速离心lOOrnin;
[0032] 7)所得沉淀用1?悬浮后8 OOOrpm离心15min，收集上清液，沉淀再悬浮、离心，重复 3次；
[0033] 8)将合并上清液加到超离管中，用注射器针头吸取30%蔗糖加到超离管的底部形 成鹿糖垫，33 OOOrpm超速离心lOOmin;
[0034] 9)所得沉淀用适量pH 7.5的0.01M PB(含0.01M MgC12)悬浮，33 OOOrpm超速离心 lOOmin，去除鹿糖垫；
[0035] 10)所得沉淀用0.01M PB悬浮，所得悬浮液即为病毒提纯液；
[0036] 11)病毒提纯液经3%磷钨酸(？!16.7)负染后，置于邛01^贝1-120(^乂电镜下观察 发现大量高纯度的PVS粒子。
[0037] 2.免疫动物
[0038] 用提纯的PVS病毒粒子免疫8周龄BALB/c