一种曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开一种曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，同时提供了 该系统的制备方法，属于肿瘤靶向与缓释给药系统技术领域。
【背景技术】
[0002] 紫杉醇是临床上广泛应用的抗肿瘤药物，可以诱导和促进微管蛋白聚合，防止解 聚，使微管蛋白保持稳定，抑制有丝分裂，发挥抗肿瘤作用。紫杉醇具有高效、低毒及广谱抗 癌活性，尤其对乳腺癌和卵巢癌有独特疗效，其注射液是治疗乳腺癌、卵巢癌、肺癌等实体 肿瘤的一线用药。但由于紫杉醇水溶性差，制成注射制剂有一定困难。目前临床常用的紫 杉醇注射液（Taxol)采用聚氧乙烯蓖麻油等作为溶媒，可促进组胺释放，引起严重的过敏反 应。此外注射型紫杉醇靶向性差，易引起全身毒性，因此临床上迫切需要研发紫杉醇的新型 给药系统，以克服缺陷。
[0003] PLGA，生物可降解性聚乳酸-羟基乙酸共聚物，作为药物载体具有良好的生物相 容性和稳定性，能够包裹疏水性的紫杉醇，但PLGA纳米粒粒径普遍较大，不利于静脉注射。 由磷脂材料构成的脂质体，类似生物膜结构，具有粒径小，生物相容性好，增加细胞摄取及 内体逃逸，延缓药物释放等优势，但稳定性较差。聚合物脂质纳米粒是结合了聚合物和磷脂 二者优点开发的一种具有核壳结构的新型给药系统。将紫杉醇载入聚合物脂质纳米粒，存 在以下优点：粒径小，药物包封率高，生物相容性好，释放行为学可控，结合配体分子后靶向 性增强。从而提高了主动靶向，降低紫杉醇毒副作用，减少紫杉醇用量，增加患者顺应性。
[0004] 某些肿瘤细胞表面过量表达受体，可以结合特异性配体。利用这种配体导向 作用，可以将化疗药物递送到特定肿瘤组织或细胞，从而实现靶向治疗。曲妥珠单抗 (Trastuzumab)是人表皮生长因子受体-2 (HER2)的单克隆抗体，可以识别并结合HER2过 表达的肿瘤细胞，如乳腺癌，卵巢癌，肺癌细胞等。曲妥珠单抗具有蛋白类大分子分子量大 及空间结构复杂等特点，在纳米粒制备过程中易受到操作环境的影响，从而失去活性。在载 药纳米粒基本形成后，通过纳米粒表面引入的Mal基团，与抗体在温和的条件下反应，从而 将抗体连接在纳米粒表面，可以保持抗体的天然活性，从而提高靶向效应。因此，通过HER2 受体介导的纳米传递系统，为HER2过表达的肿瘤治疗提供了潜力的途径。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，为特异性靶 向HER2过表达肿瘤细胞的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，解决了目 前紫杉醇制剂存在的缺陷及纳米粒载体材料单一的缺陷。
[0006] 本发明进一步提供曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统的制备方 法。
[0007] 本发明所述的一种曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，通过以下 技术方案实现： 由聚合物PLGA和磷脂为载体材料制备的核壳结构的聚合物脂质纳米粒、包载于纳米 粒中的紫杉醇及纳米粒表面的修饰配体曲妥株单抗构成。
[0008] 本发明所述的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，其特征在于： PLGA 为羧基封端，型号 5050 IA 或 5050 I. 5A，黏度为 0. 16 ~ 0. 20 dL/g。
[0009] 本发明所述的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，其特征在于： 其中的磷脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺。
[0010] 本发明所述的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，其特征在于： 紫杉醇：PLGA :二棕榈酰磷脂酰胆碱：磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺的质 量比为（1〇~15) :60 :(15~20) :10。
[0011] 本发明所述的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，其特征在于其 中的曲妥株单抗与磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺的摩尔比为1 :5~1。
[0012] 本发明所述的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统的制备方法，包 括以下步骤： 1) 采用改良的乳化溶剂挥发法制备包裹并运载紫杉醇的PLGA /Lipid纳米粒； 2) 采用化学偶联的方法，使用活化试剂将曲妥株单抗的某个氨基巯基化，与纳米粒表 面的Mal基团发生加成反应，形成硫醚键，进而将配基与纳米粒连接。
[0013] 本发明所述的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤： 1) 称取10~15 mg的紫杉醇和60 mg的PLGA溶解于2. 4 mL的丙酮中，称取15~20 mg 的DPPC和10 mg DSPE-PEG2000-Mal溶解于I. 6 mL的乙醇中；混合丙酮乙醇溶液(积比为 3 :2)形成二元有机相（0相)，加入适量I. 0 ~ 2. 0%泊洛沙姆188水溶液（W相），0 ~ 4°C 下间断超声分散制备0/W乳剂，再补充10~20 mL的I. 0 ~ 2. 0%泊洛沙姆188水溶液，室 温低速搅拌，过夜挥发除去二元有机相，过膜除去大粒径纳米粒，并离心收集纳米粒，冷冻 干燥； 2) 在20°C、pH 8. 0缓冲液孵育条件下，使用活化试剂将曲妥珠单抗的一部分氨基巯基 化，与纳米粒表面的Mal基团发生加成反应，形成硫醚键，进而将配基与纳米粒连接，离心 洗涤除去未反应的单抗，并收集纳米粒，即得曲妥珠单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传 递系统。
[0014] 本发明所述的制备方法，其特征在于： 氨基活化试剂是2-亚氨氢氯化硫醇，使用浓度为6 ~ 7 mg/mL，用量范围为20 ~ 100 μ L0
[0015] 本发明所介绍的二元溶剂乳化挥发法制备的PLGA/Lipid纳米粒传递系统，包裹 的药物不仅限于紫杉醇，还可拓展为其它与PLGA具有良好生物相容性的疏水性化疗药物； 偶联的配体也不仅限于曲妥株单抗，还可包括那些具有靶向性的小分子多肽及其它种类的 单克隆抗体。
[0016] 本发明制备的革巴向纳米粒（T=PCNs )为冻干制齐Ij，属于静脉给药系统。对于静脉给 药系统，溶剂通常为无菌水溶液。适当的调整溶液PH值并使溶液等渗(如加入氯化钠或葡 萄糖)，即适合静脉给药，纳米粒采取过〇. 22 μ m无菌滤膜的方式灭菌。
[0017] 本发明的积极效果在于：结合了 PLGA和磷脂的优点并与单克隆抗体联合，制备了 具有核壳结构的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒（T=PCNs),形成具有核壳结构的 纳米级微粒；解决了现有紫杉醇制剂存在的缺陷及纳米粒载体材料单一的不足。具有粒径 小（150 ~ 200 nm)，更有利于细胞摄取（〈200 nm)，药物包封率高（75 ~ 83%)，在溶液中稳 定性好（电位0 mV左右)，生物相容性好，增加内体逃逸，释放行为学可维持紫杉醇治疗水 平，结合曲妥株单抗后更实现了药物的主动靶向性。提高了 HER2过表达的肿瘤细胞的摄取 效率，极大的提高了紫杉醇的安全性和靶向性。本发明构建的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇 的靶向纳米粒传递系统，是一种优良的递药系统，有望应用于HER2过表达的乳腺癌、卵巢 癌及肺癌等实体肿瘤的治疗。
【附图说明】
[0018] 图1为纳米粒的示意图； 图2为纳米粒的粒径电位分布图：（A)PCNs粒径分布；（B)T=PCNs粒径分布；（C)PCNs 电位分布；（D) T=PCNs电位分布； 图 3 为纳米粒的 SEM 图；（A) PCNs ; (B) T=PCNs ; 图4为纳米粒的体外释药曲线； 图 5 为 PTX，HER，PCNs，T=PCNs 对 SKBR3 (A)和 MCF7 细胞（B)的细胞毒性； 图6为SKBR3和MCF7细胞对T=PCNs摄取的激光共聚焦结果； 图7为SKBR3和MCF7细胞对T=PCNs摄取的流式细胞仪结果：（A)直方图（B)柱形图。 具体实施方案
[0019] 下面结合具体实施例对本发明进行详细描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此： 实施例1: 1、 称取紫杉醇10 mg和PLGA IA 60mg溶解于2. 4 mL丙酮中，称取DPPC 20 mg和 DSPE-PEG2000-Mal 10 mg溶解于1.6 mL的乙醇中。混合丙酮乙醇溶液形成二元有机相（0 相)，加入15 mL LO ~ 2.0%泊洛沙姆188水溶液（W相)，0 ~ 4°C下间断超声（100 W，150 s)分散制备0/W乳剂，再补充15 mL的I. 0 ~ 2. 0%泊洛沙姆188水溶液，室温低速搅拌 (150 rpm)，过夜挥发除去二元有机相，0. 22 μ m微孔滤膜过滤，并离心收集纳米粒（18000 rpm，15 min)，冷冻干燥； 2、 取 20 yL、6 mg/mL Traut's Reagent，加入 I mL、l mg/mL 曲妥株单抗溶液（pH 8.0 PBS)，20°C条件下活化2 h，再加入5 mg上述纳米粒，20°C条件下孵育18 h，离心洗涤除去 未连接的单抗（18000 rpm，15 min)，冷冻干燥，即获得曲妥珠单抗修饰的载紫杉醇的革巴向 纳米粒。
[0020] 实施例2: 1、称取紫杉醇15 mg和PLGA IA 60mg溶解于2. 4 mL丙酮中，称取DPPC 15 mg和 DSPE-PEG2000-Mal 10 mg溶解于1.6 mL的乙醇中。混合丙酮乙醇溶液形成二元有机相（0 相)，加入15 mL LO ~ 2.0%泊洛沙姆188水溶液（W相)，0 ~ 4°C下间断超声（100 W，150 s)分散制备0/W乳剂，再补充15 mL的I. 0 ~ 2. 0%泊洛沙姆188水溶液，室温低速搅拌 (150 rpm)，过夜挥发除去二元有机相，0. 22 μ m微孔滤膜过滤，并离心收集纳米粒（18000 rpm，15 min)，冷冻干燥； 2、取 20 yL、6 mg/mL Traut's Reagent，加入 I mL、l mg/mL 曲妥株单抗溶液（pH 8.0 PBS)，20°C条件下活化2 h，再加入5 mg上述纳米粒，20°C条件下孵育18 h，离心洗涤除去 未连接的单抗（18000 rpm，15 min)，冷冻干燥，即获得曲妥珠单抗修饰的载紫杉醇的革巴向 纳米粒。
[0021] 实施例3: 1、 称取紫杉醇10 mg和PLGA I. 5A 60mg溶解于2. 4 mL丙酮中，称取DPPC 20 mg和 DSPE-PEG2000-Mal 10 mg溶解于1.6 mL的乙醇中。混合丙酮乙醇溶液形成二元有机相（0 相)，加入15 mL LO ~ 2.0%泊洛沙姆188水溶液（W相)，0 ~ 4°C下间断超声（100 W，150 s)分散制备0/W乳剂，再补充15 mL的I. 0 ~ 2. 0%泊洛沙姆188水溶液，室温低速搅拌 (150 rpm)，过夜挥发除去二元有机相，0. 22 μ