后调pH 9. 0,加 热50°C使蛋白质变性，加硅藻土助滤除去变性蛋白质，等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机 相，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得到产物，测定光学纯度，纯度95. 0~97. 0 %，摩尔收 率 93%，e. e.值 >99%。
[0066] 实施例7酶活测定方法
[0067] 酶活的定义为每分钟消耗1 μ mol NADPH所需要的酶量为1U。
[0068] 酶活测定方法是：在2mL反应液中，加入2mM苯乙酮为底物，0.1 mMNADPH为辅因 子，再加入20 μ L粗酶液，测定2分钟内0D34。的降低速度为Δ A 34。。每mL酶液的比酶活U =Δ A34。X 100(V(6220X20)，即每mL裂解液的比酶活力。
[0069] TLC 条件：EA:PE = 1:3,碘缸显色。
[0070] GC检测反应进度，GC条件为：初始温度100°C，每分钟升高10°C，终温280°C ;
[0071] ee 值测定：Chiralpak ΙΑ 柱（4. 6X 150mm)，庚烧：乙醇=92:8,40 °C，1. 5mL/ min，254nm，Agilentl260。保留时间：2S, 3R-异构体：6. 5min ;2R, 3S-异构体：8. 7min ; 2R, 3R-异构体：9. lmin ;2S, 3S-异构体：9. 9min。底物：1L 3min 和 13. lmin。
[0072] 实施例8产物转化为4-AA
[0Π7^?
[0074] a)将式II的（2S，3R)-2-苯甲酰胺基甲基-3-羟基丁酸甲酯用10~25%的盐酸 水溶液在100°c搅拌反应5小时，反应溶液冷却至室温，依次用二氯甲烷和乙酸乙酯洗涤， 水溶液浓缩得到固体，将该固体用3~20倍体积的乙醇溶解，加入氢氧化钠溶液搅拌1小 时，将反应液减压浓缩得到白色固体，即式A化合物。
[0075] b)将上步的式A化合物中加入等当量的三苯基膦和二吡啶基二硫化物，当量的三 乙胺，加入80当量的乙腈，在80°C搅拌反应15小时，反应结束后将反应液浓缩，残余油状物 柱层析分离得到式B化合物。
[0076] c)将上述的式B化合物用二氯甲烷溶解，加入2当量的三乙胺，然后加入1. 5当量 的二甲基叔丁基硅基氯，室温搅拌反应4小时，反应结束后，将反应液用饱和食盐水洗涤， 有机相浓缩得到式C化合物。
[0077] d)将上述式C化合物溶于乙腈中，加入0. 1当量的RuC13，在-5~0°C滴加含有 1.5当量的过氧乙酸的乙酸溶液，滴加完毕搅拌反应2小时，减压蒸除溶剂，残余物用柱层 析分离得到4-AA。总收率为65~70%。
[0078] 4-AA的核磁数据：
[0079] 虫 NMR(300MHz，CDC13) : δ 〇· 〇8(s，6H), 1. 0(s，9H), 1. 32(d，3H), 2. 01(s，3H)，3. 61 (q, 1H), 3. 74 (s, 1H).
【主权项】
1. 一种分离的醛酮还原酶，其是如下（a)、（b)或（c)的蛋白质： (a) 由SEQ ID N0:2或4所示氨基酸序列组成的蛋白质； (b) 在（a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有 酮还原酶活性的蛋白质； (c) 与（a)的氨基酸序列具有至少90%同一性且具有酮还原酶活性的蛋白质。2. 根据权利要求1所述的醛酮还原酶，其是由SEQ ID N0:4所示氨基酸序列组成的蛋 白质。3. 编码权利要求1或2所述的醛酮还原酶的分离的核酸。4. 根据权利要求3所述的核酸，其是由SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列组成的。5. 包含权利要求3或4所述的核酸的重组表达载体。6. 根据权利要求5所述的重组表达载体，其选自质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。7. 根据权利要求6所述的重组表达载体，其是pET系列质粒。8. 包含权利要求5-7任一项所述的重组表达载体的重组表达转化体。9. 根据权利要求8所述的重组表达转化体，其是大肠杆菌（E. coli)。10. 根据权利要求9所述的重组表达转化体，其是E. Coli BL21 (DE3)。11. 一种制备重组醛酮还原酶的方法，包括如下的步骤：培养权利要求8-10任一项所 述的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组醛酮还原酶。12. -种催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性羟基化合物的催化剂， 其选自权利要求8-10任一项所述的重组转化体的培养物，或通过该培养物离心分离后得 到的转化体细胞或者用其加工的制品；优选地，所述的制品是由所述转化体得到的提取物、 或通过对提取物中的醛酮还原酶进行分离和/或纯化得到的分离产品、或通过固定化转化 体细胞或提取物或提取物的分离产品而得到的固定化制品、或者通过冻干得到的冻干粉。13. 权利要求1或2所述的醛酮还原酶、权利要求11所述的方法制备的重组醛酮还原 酶、或权利要求12所述的催化剂在催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性 羟基化合物中的应用。14. 根据权利要求13所述的应用，其特征在于：式I所示的2-取代氨基甲基-3-氧代 丁酸酯化合物在权利要求1或2所述的醛酮还原酶、权利要求11所述的方法制备的重组醛 酮还原酶、或权利要求12所述的催化剂催化下发生还原反应，生成式II所示的羟基化合 物；其中， R为Cl~C6烷基，优选甲基、乙基或叔丁基； R'为氨基保护基，优选叔丁氧羰基、苄氧羰基、三苯甲基、苯甲酰基、甲酰基或三氟乙酰 基。15. 根据权利要求14所述的应用，其特征在于：式I为2-苯甲酰胺甲基-3-氧代丁酸 甲酯；式II为（2S，3R)-2-苯甲酰胺基甲基-3-羟基丁酸甲酯。16. 根据权利要求13-15任一项所述的应用，其特征在于所述的还原反应在含有氢氧 化钠溶液的pH 5. 0~8. 0的水溶液中进行。17. 根据权利要求13-15任一项所述的应用，其特征在于所述的前手性羰基化合物在 反应液中的浓度为10~l〇〇〇g/L ;所述的醛酮还原酶用量为催化有效量，较佳地为1~ 20g/L ;所述的不对称还原反应在振荡或搅拌条件下进行；反应温度为20~40°C。18. -种合成（2S，3R)-2-取代胺基甲基-3-羟基丁酸酯的方法，包括：在pH 5. 0~8. 0 的水溶液中，在权利要求12中所述的醛酮还原酶冻干粉催化下，在NADP+、葡萄糖和葡萄糖 脱氢酶存在下，前手性羰基化合物进行不对称还原反应，形成光学活性手性羟基化合物。19. 一种合成（2S，3R)-2-取代胺基甲基-3-羟基丁酸酯的方法，包括：在pH 5. 0~8. 0 的水溶液中，在权利要求1或2所述的醛酮还原酶、权利要求11所述的方法制备的重组醛 酮还原酶、或权利要求12所述的催化剂催化下，在葡萄糖和葡萄糖脱氢酶存在下，前手性 羰基化合物进行不对称还原反应，形成光学活性手性羟基化合物。
【专利摘要】本发明提供了一种新的醛酮还原酶突变体及利用重组醛酮还原酶突变体或其冻干粉进行不对称还原的方法。在催化浓度高达1000g/L的底物时，产物的光学纯度仍高达98％以上，且不需要额外添加昂贵的辅酶。相对于其它不对称还原制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，并且具有产物光学纯度高、反应条件温和、对环境友好、操作简便、易于工业放大的优点，因此具有很好的工业应用前景。
【IPC分类】C12P13/00, C12R1/19, C12N15/63, C12N1/21, C12N9/02, C12P13/02, C12N15/53
【公开号】CN105624125
【申请号】CN201410706195
【发明人】罗煜, 丁时澄, 瞿旭东, 李辉, 王海涛
【申请人】南京博优康远生物医药科技有限公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年11月26日