分泌抗番茄黑环病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗番茄黑环病毒单克隆抗体的杂交 瘤细胞株及其单抗的应用。
【背景技术】
[0002] 番前黑环病毒（Tomato black ring nepovirus，TBRV)隶属β??花叶病毒科 (Comoviridae)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)，最早由史密斯于1946年在英国的番前上 发现，随后意大利、德国、罗马尼亚、匈牙利、法国、波兰、英国等地的科研人员也相继从各种 植物上分离出番茄黑环病毒。它既可以通过种子，也可以通过土壤和植物繁殖材料进行远 距离传播。因此，TBRV已成为一种全球性的作物病毒，它在许多欧洲国家如法国、芬兰、瑞 典、俄国、德国均有分布，在一些亚洲国家如印度、日本和土耳其也有分布，美国、加拿大、肯 尼亚和巴西也有发现，在中国的局部地区也有发生。由于该病毒传播的广泛性和为害的严 重性，已被列入我国口岸十分关注的检疫性有害生物。
[0003] TBRV病毒粒子呈球形，直径为28nm，病毒粒子带有突起。蛋白质外壳可能由排列在 T=1的二十面体结构的60个多肽亚单位组成。TBRV的钝化温度为60-65°C;室温下体外保毒 期为14-21d，稀释限点为10- 3-10-4。病毒纯化时分为顶部组分(T)、中部组分(M)和底部组分 (Β)，沉降系数分别为53S(T)、97S(M)和121S(B)，在CsCl中的浮力密度为1.5g.cnf 3(B)、 1.44g.cm_3(M)和1.285g.cnf3(T)。病毒含有两个基因组ssRNA，即存在于B组分中的RNA-1和 Μ组分中的RNA-2。据报道，番茄黑环病毒有两个血清型，即德国血清型和苏格兰血清型。 Greif等（1988年）和Meyer等（1986年）发现德国血清型的全基因组序列测定为7,356nt (尺麻-1)和4,6621^(1?财-2)。1^6311等（1995年）发现苏格兰血清型的1?财-2为4,6181^。 Robinson等（1980年）认为RNA-1可独立于RNA-2进行复制，但是Murant等（1973年）研究发 现:两个基因组RNA-1和RNA-2是TBRV侵染植物所必需的。其中RNA-1编码的蛋白与病毒在植 物体内的复制有关，RNA-2编码的蛋白为外壳蛋白和胞间运动蛋白。
[0004] 番茄黑环病毒的寄主范围很广，能够侵染单子叶和双子叶植物，包括许多重要的 经济作物，如葡萄和一些果树、甜菜、马铃薯和蔬菜(葱属、甜菜属、芸薹属、莴苣属、番茄属 和菜豆属的一些种）以及观赏植物，还能侵染乔木和灌木以及一些杂草品种，最主要的寄主 是悬钩子属、茶属、草莓属和李属植物中的一些种(特别是桃）。它可以使番茄上产生黑色环 斑，在菜豆、甜菜、莴苣、悬钩子上引起环斑，还引起芹菜的黄脉，马铃薯的"花束和假珊瑚 状"，桃子的新枝矮缩等症状。感染TBRV还可导致浆果变小溃疡，产果率下降。对于正常生长 可以产果20年的果树，感染TBRV后其产果时间缩短至4-5年。番茄黑环病毒以线虫传播和种 子传播为主，其中TBRV马铃薯花束株系可以通过菟丝子传毒。由于线虫介体只能短距离传 播，因此被害的种子和苗木等植物繁殖材料是该病毒国际间传播和扩散的重要根源。草本 植物可以通过机械摩擦传毒，当机械接种草本试验植株时，大多数TBRV株系侵染不同植物 产生不同的症状:如侵染昆诺藜，7d内变色或局部坏死，以后系统性褪绿斑驳、坏死或叶片 变形。侵染不同烟草品种表现不同的症状，有些烟草晚期叶片虽然无症状，但仍含有病毒。 木质植物机械接种很难，试验发现为了减少植物多酚对抑制病毒侵染性的影响，用2%烟碱 溶液或者高pH(9.3)缓冲液研磨病组织接种木本植物可以获得成功。
[0005] TBRV寄主范围广、传播途径多、适生性强，伴随着我国进出境贸易的高速增长，番 茄黑环病毒传入我国并危害流行的可能性极大，给我国的农林生产带来了潜在的威胁。当 前，国内外关于番茄黑环病毒的检验检疫分子生物学技术已有较多报道，但应用血清学检 测的报道较少，分子生物学方法虽然特异、灵敏，但需昂贵精密的仪器且对操作人员技术要 求较高，并不适合大批量样品检测。而血清学的方法操作简单、特异性好，且可以规模化检 测大量样品，但其必须依赖于特异、灵敏的优质抗体。因此，本发明专利主要针对番茄黑环 病毒单克隆抗体的制备及其检测应用开展工作，利用杂交瘤技术制备了 1株能分泌抗TBRV 单抗杂交瘤细胞12H3,并用其分泌的单抗建立了检测该病毒的血清学方法和检测试剂盒， 从而为我国番茄黑环病毒病的检验检疫，科学指导防控提供物质和技术支持。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗番茄黑环病毒单抗杂交瘤 细胞株及其单抗的应用。
[0007] 分泌抗番茄黑环病毒单抗的杂交瘤细胞株12H3,它能分泌抗番茄黑环病毒的特异 性单抗，杂交瘤细胞株12H3于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，保藏号为CGMCC No. 12005。
[0008] 一种所述的杂交瘤细胞株12H3分泌的抗番茄黑环病毒单抗，抗番茄黑环病毒的单 抗腹水间接ELISA效价达10- 7,抗体类型及亚类为IgGl、kappa轻链，该单抗与50kDa的番前黑 环病毒外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA方法分析发现该单抗检测感染TBRV病 叶的灵敏度达到1:163,840倍稀释(￥八，8/111〇。
[0009] 抗番茄黑环病毒的单抗仅与番茄黑环病毒有特异性免疫反应，而与番茄花叶病 毒、番茄褪绿病毒、烟草环斑病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄斑萎病毒和健康的番茄叶片粗 提液均不发生任何免疫反应。
[0010] 抗番茄黑环病毒单抗在抗番茄黑环病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各 种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。
[0011] 本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株12H3分泌抗番茄 黑环病毒特异性单抗，以该单抗为核心建立的dot-ELISA和ACP-ELISA等免疫学方法及用这 些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏地检测番茄黑环病毒;2)利用本发明所制备的 单抗检测番茄黑环病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备;3)利用本发明所制备的 单抗可有效地用于田间及口岸作物中的番茄黑环病毒的检验检疫和检测。
【附图说明】
[0012] 图1是dot-ELISA方法检测TBRV的灵敏度分析；
[0013] 图2是dot-ELISA方法检测TBRV的特异性分析；
[0014] 1列上下2个斑点为2个感染TBRV的番茄叶片样品，2列上下2个斑点为2个感染番茄 花叶病毒的番茄叶片样品，3列上下2个斑点为2个感染番茄褪绿病毒的番茄叶片样品，4列 上下2个斑点为2个感染烟草环斑病毒的番茄叶片样品，5列上下2个斑点为2个感染番茄黄 化曲叶病毒的番茄叶片样品，6列上下2个斑点为2个感染番茄斑萎病毒的番茄叶片样品，7 列上下2个斑点为2个健康番茄叶片样品，8列上下2个斑点为2个健康烟草叶片样品。
[0015] 图3是dot-ELISA方法检测口岸植物样品中TBRV的代表性结果；
[0016] 图4是RT-PCR方法检测口岸植物样品中TBRV的代表性结果。
[0017]生物保藏
[0018] 杂交瘤细胞株12H3于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCC No. 12005，其分类命名为:分泌抗番茄黑斑病毒(TBRV)单抗杂交瘤细胞。
【具体实施方式】
[0019] 分泌抗番茄黑环病毒单抗杂交瘤细胞株12H3于2016年1月7日保藏于中国科学院 微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 12005,它能分泌抗番茄黑环病毒的单克隆抗体。
[0020] 一种所述的杂交瘤细胞株12H3分泌的抗番茄黑环病毒单抗，抗番茄黑环病毒的单 抗腹水间接ELISA效价达10- 7,抗体类型及亚类为IgGl、kappa链，与50kDa番茄黑环病毒的外 壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA方法分析发现该单抗检测病叶的灵敏度达到1: 163，840倍稀释