检测18种高危型hpv核酸的引物、探针及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测18种高危型HPV核酸的探针，包括以下序列的探针：寡核苷酸序列SEQ ID No：1～15；寡核苷酸序列SEQ ID No：46；寡核苷酸序列SEQ ID No：49；寡核苷酸序列SEQ ID No：52；寡核苷酸序列SEQ ID No：55。本发明还涉及一种检测18种高危型HPV核酸的引物和试剂盒。本发明提供的检测引物、探针与试剂盒在可对HPV16、18和58型进行分型，可以更好的罹患宫颈癌风险的提示效果。
【专利说明】
检测18种高危型HPV核酸的引物、探针及试剂盒
技术领域
[0001]本发明设计核酸检测技术，特别涉及一种检测18种高危型HPV核酸的引物、探针及 试剂盒。
【背景技术】
[0002] HPV是一种嗜上皮性病毒。根据HPV致癌风险性大小，可将引起高度宫颈上皮内瘤 变（Cervical intraepithelial neoplasia，CIN)从而导致宫颈癌发生的HPV称为高危型 HPV(high-risk HPVjR-HPVhSOCM年出版的《The Health Professional's HPV handbook》指出高危型 HPV 有 18 种，分别为 HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、 59、66、68、73、82。
[0003] 目前国内临床主要的HPV检测方法有荧光PCR法、杂交捕获法、基因芯片法。现有荧 光PCR法产品有以下三大缺点：1、现有荧光定量PCR检测试剂多数不对HPV16、HPV18分型。2、 现有可对HPV16、HPV18具体分型的荧光定量PCR专利不可实现同时区分中国人群宫颈癌样 本中检出率明显较高的HPV58和实现对导致宫颈癌的18种HPV高危型(HPV16、18、26、31、33、 35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82)进行检测。3、现有可同时对册￥16、册￥18与 HPV58具体分型的荧光定量PCR检测试剂均不能实现仅需单管检测，致使检测通量低且操作 繁琐难以满足对大规模筛查要求。
[0004] 而杂交捕获法缺点是:无内标、检测时间长(DNA分解45min、DNA-RNA杂交60min、抗 体捕获60min、化学发光30min、计算机判读15min-次实验一般要5~6小时）、灵敏度过低 (3.5X105C〇pie S/mL)、操作复杂、检测基因型少无法具体分型(仅13种高危型)且需要特定 昂贵的仪器，成本高，和其检测外的高危型和低危型如HPV6、11等存在交叉反应，会出现假 阳性结果。PCR-反向点杂交法、液态芯片法等基因芯片法类产品虽然能对HPV具体分型，且 检测基因型相对多，但其缺点是不能实现实时检测，需要扩增后产物分析操作，耗时长(4h 以上）、易存在PCR产物污染、操作复杂、不能满足临床宫颈癌大量筛查的需求。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是:提供一种可具体区分HPV16、HPV18与HPV58的检测 18种高危型HPV核酸的引物、探针及试剂盒。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为:一种检测18种高危型HPV核酸 的探针，包括以下序列的探针：与HPV26型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、 56型、59型、66型、68型、73型和82型的基因序列互补配对的寡核苷酸序列SEQ ID No: 1~ 15;与HPV16型的基因序列互补配对的寡核苷酸序列SEQ ID N〇:46;与HPV18型的基因序列 互补配对的寡核苷酸序列SEQ ID No:49;与HPV58型的基因序列互补配对的寡核苷酸序列 SEQIDNo:52;与人类β-actin基因的基因序列互补配对的寡核苷酸序列SEQIDNo :55。
[0007] 本发明还提供了一种检测18种高危型HPV核酸的引物，包括以下序列的引物：与 HPV26 型、31 型、33 型、35 型、39 型、45 型、51 型、52 型、53 型、56 型、59 型、66 型、68 型、73 型和 82 型的基因序列互补配对的寡核苷酸序列SEQ ID No:16~45;与HPV16型的基因序列互补配 对的寡核苷酸序列SEQ ID N〇:47~48;与HPV18型的基因序列互补配对的寡核苷酸序列SEQ ID No:50~51;与HPV58型的基因序列互补配对的寡核苷酸序列SEQ ID No:53~54;与人类 β-actin基因的基因序列互补配对的寡核苷酸序列SEQIDNo:56~57。
[0008] 本发明还提供了一种检测18种高危型HPV核酸的试剂盒，包括反应液，所述反应液 包括检测18种高危型HPV核酸的探针和引物，所述探针包括寡核苷酸序列SEQ ID No: 1~ 15、SEQ ID No:46、SEQ ID No:49、SEQ ID No:52和SEQ ID No:55,所述引物包括寡核苷酸 序列SEQ ID No:16~45、SEQ ID No:47~48、SEQ ID No:50~51、SEQ ID No:53~54和SEQ ID No:56~57〇
[0009] 本发明的有益效果在于：
[0010] (1)本发明的检测引物、探针与试剂盒能够全面覆盖国际公认和宫颈癌密切相关 的 18 种高危型册￥(册￥16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82型）， 同时对中国人群风险度最高的3种高危型HPV(HPV16、18和58型）分型，比现有试剂盒更好的 提示罹患宫颈癌的风险，更适合中国人群宫颈癌筛查；
[0011] (2)本发明的检测方法只需要单一反应管，检测时间不超过1.5h，具有快速、简便 和高通量的优点，特别适用于大样本检测。
【附图说明】
[0012]图1为本发明实施例的第一组15种高危型HPV在ABI Prism 7500上的检测结果的 扩增曲线；
[0013]图2为本发明实施例的第二组HPV16在ABI Prism 7500上的检测结果的扩增曲线； [0014]图3为本发明实施例的第三组HPV18在ABI Prism 7500上的检测结果的扩增曲线； [0015]图4为本发明实施例的第四组HPV58在ABI Prism 7500上的检测结果的扩增曲线； [0016]图5为本发明实施例的第五组人类β-actin基因在ABI Prism 7500上的检测结果 的扩增曲线；
[0017] 图6为本发明实施例的含第一组至第五组的DNA在ABI Prism 7500上的检测结果 的扩增曲线。
【具体实施方式】
[0018] 为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式 并配合附图详予说明。
[0019] 本发明最关键的构思在于：设计出可检测18种高危型HPV核酸且同时可具体区分 即￥16、即￥18与即￥58的引物和探针序列。
[0020] 请参阅图1至图6，本发明提供了基于Taqman探针法的实时荧光PCR技术的15+3种 高危型HPV的检测引物与探针，包括：
[0021] (1)具有仅与15种高危型册￥即册￥26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、59、66、68、 73、82的基因序列互补配对的寡核苷酸。其中SEQ ID No: 1~15为探针，SEQ ID No: 16~45 为引物。
[0022] (2)具有仅与HPV16的基因序列互补配对的寡核苷酸。其中，SEQ ID N〇:46为探针， SEQ ID No:47~48为引物。
[0023] (3)具有仅与HPV18的基因序列互补配对的寡核苷酸。其中，SEQ ID N〇:49为探针， SEQ ID No:50~51 为引物。
[0024] (4)具有仅与HPV58的基因序列互补配对的寡核苷酸。其中，SEQ ID N〇:52为探针， SEQ ID No:53~54为引物。
[0025] (5)具有仅人类β-actin基因的基因序列互补配对的寡核苷酸。其中，SEQ ID No: 55为探针，SEQ ID No:56~57为引物。
[0026] 其中，上述每组探针的5'端分别标记最大发射光波长为510~518nm、538~560nm、 563~583nm、600nm~610nm、640~670nm和705~715nm中的报告基团的其中一种，并且每组 之间相互不同。同时，根据上述每组探针5'端标记报告基团的最大发射光波长，在3'端对应 标记的泮灭基团可在吸收光波长为380~550nm、470~560nm、480~580nm、550~650nm和 620~730nm中进行选择。
[0027] 作为优选方案，每组探针具体的报告基团与淬灭基团按下表1选择。表1为报告基 团与对应选择的淬灭基团的选择列表。
[0028] 表 1
[0030] 作为最优选方案，每组探针具体的报告基团与淬灭基团按下表2选择。表2为报告 基团与对应选择的淬灭基团的优先选择列表。
[0031] 表2
[0033] 本发明的具体探针和引物的排序与核酸序列如下表3。表3为本发明的检测18种 HPV核酸的探针与引物的序列号、名称及核酸序列的列表。
[0034] 表 3
[0038] 基于以上所述检测15+3种高危型HPV核酸的引物与探针，本发明还提供了一种检 测15+3种高危型人乳头瘤病毒核酸的试剂盒。
[0039] 作为优选方案，上述检测15+3种高危型HPV的试剂盒包括PCR反应液、酶(例如热启 动酶）、阴性质控品和阳性质控品。
[0040] 作为优选方案，上述反应液为l.lmL/管，共1管。包括上述检测15+3种高危型HPV核 酸的引物与探针、10XPCR buffer、25mM MgCl2、25mM dN(U)TP、lU/yL UNG。引物浓度均为 100μM，用量均为2.5μL。探针浓度均为100μM，其中寡核苷酸序列为SEQIDNo:55的探针的 用量为〇.75yL，其余探针用量为l.SyLlOXPCR buffer用量为125yL，25mM MgCl2用量为 150yL，25mM dN(U)TP用量为10yL，lU/yL UNG用量为5yL，最后用纯水补足至l.lmL。
[0041] 作为优选方案，上述酶具备热启动功能，可为热启动酶，为60μ!7管，共1管，浓度为 5UAxL。作为优选方案，上述阴性质控品为Ing/yL人基因组DNA。作为优选方案，上述阳性质 控品为Ing/yL人基因组DNA以及1 · 0 X 105copies/mL的HPV16、HPV18和HPV58全基因组质粒 的混合物。作为优选方案，上述检测15+3种高危型HPV的试剂盒使用方法如下：
[0042] 1、配制并分装Master mix:按反应液：22yL/test、酶：lyL/test以配置分装。
[0043] 2、加入PCR模板:将待检DNA样本、阴性质控品、阳性质控品按2yL/test加入Master mix。
[0044] 3、荧光PCR检测，设置报告基团为?舰、￥1(：、呢0、1?(?、075，信号收集设置在55°(：。反 应条件与程序如下：
[0046] 4、结果判读:如果该组报告基团没有出现S型扩增曲线，则对应检测靶标为阴性； 如果该组检测靶标Ct值<38且出现S型扩增曲线，则对应检测靶标为阳性;如果样本DNA人 类β-actin基因与15+3种高危型HPV均为阴性，则实验失败，需要对采样、DNA提取、PCR抑制 等因素进行分析。
[0047] 本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
[0048] (1)本发明的检测引物、探针与试剂盒能够全面覆盖国际公认和宫颈癌密切相关 的18种高危型HPV，同时对中国人群风险度最高的HPV16、HPV18和HPV58的3种高危型HPV分 型，比现有试剂盒更好的提示罹患宫颈癌的风险，更适合中国人群宫颈癌筛查；
[0049] (2)本发明的检测方法只需要单一反应管，检测时间<1.5h，具有快速、简便和高 通量的优点，特别适用于大样本检测。
[0050] 以下通过实施例对本发明详予说明。
[0051] 以下实施例使用Applied Biosystems 7500Real_time PCR System进行。
[0052] 本实施例提供了一种检测18(15+3)种高危型HPV核酸的试剂盒，可以对高危型HPV 的个体感染情况进行定性检测，可检测18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、 51、52、53、56、58、59、66、68、73和82，并且同时对册￥16、册￥18和册￥58分型。可用于临床册￥ 感染辅助诊断和宫颈癌的早期筛查。
[0053] 上述试剂盒组成成分如下表4,表4为本发明的检测18种高危型HPV核酸的试剂盒 的组成成分表。
[0054] 表 4
[0056]其中反应液所含探针的报告基团和淬灭基团标记如下表5。表5为上述试剂盒中的 PCR反应液所含探针的报告基团和淬灭基团标记列表。
[0057]表 5
[0059]样本采集与处理：
[0060] 1、采样方法
[0061]以专用宫颈脱落细胞采集器进行采样。医护人员先以窥阴器或阴道张开器暴露宫 颈，用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去。取出宫颈刷置于宫颈口，单方向旋转4~5周以获 得足量的上皮细胞样本，然后将宫颈刷头部放入洗脱管中，沿刷柄折痕处将宫颈刷柄折断， 旋紧洗脱管盖，做好样本标识，并保持洗脱管直立放置。
[0062] 2、样本保存:标本一经采集，应尽快送检;标本室温保存不超过12小时，2~8°C保 存不超过7天，-20°C保存不超过3个月。避免反复冻融。
[0063] 3、样本运输:泡沫箱加冰袋密封运输，在途时限不宜超过48小时。
[0064] 4、样本DNA提取：样本DNA提取采用亚能生物技术（深圳）有限公司核酸提取试剂 (病原体DNA(离心柱型）），操作严格按照相关要求进行。
[0065] 样本检测：
[0066] 1、配制并分装Master mix:按反应液:22yL/test、酶：lyL/test进行配制并分装。
[0067] 2、加入PCR模板:将待检DNA样本、阴性质控品、阳性质控品按2yL/test加入Master mix〇
[0068] 3、荧光PCR检测，设置报告基团为?41^1(：、呢0、1?(?、〇75，淬灭基团均选择11〇116，信 号收集设置在55°C。反应条件与程序如下：
[0070]结果判读：
[0071] 1、如果该组报告基团没有出现S型扩增曲线，则对应检测靶标为阴性；
[0072] 2、如果该组检测靶标Ct值彡38且出现S型扩增曲线，则对应检测靶标为阳性；
[0073] 3、如果第一组~第四组靶标Ct值为(38,40)则需要重检，重检结果为<40为阳性， 否则为阴性。
[0074] 4、如果样本DNA人类β-actin基因与15+3种高危型HPV均为阴性，则实验失败，需要 对采样、DNA提取、PCR抑制等因素进行分析。
[0075] 5、由于不同报告基团焚光值(ARn)不一，建议在结果分析时，单独选择一种检测 靶标进行分析，并在必要时手动调整纵坐标即荧光值(ARn)数值，以便更好地识别S型扩增 曲线。
[0076] 请参照图1、图2、图3、图4、图5以及图6,图1至图6均出现S型扩增曲线且Ct值彡38， 即为阳性。
[0077] 为评价本发明试剂盒的准确性与有效性，对200例有病变的宫颈脱落细胞样本与 人乳头瘤病毒基因分型(39型)检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)做对比实验。评价指标采用 阳性符合率与阴性符合率，统计分析采用配对计数资料统计，如下表6。表6为对比实验的实 验数据统计根据表。
[0078] 表 6
[0080]阳性符合率和阴性符合率的计算公式为：
[0081 ]阳性符合率=a/ (a+c) * 100 % ;阴性符合率=d/ (b+d) * 100 %。
[0082] 本发明的上述试剂盒与人乳头瘤病毒基因分型(39型)检测试剂盒(PCR-反向点杂 交法)对18种高危型HPV检测结果统计见表7,表7为本发明的上述试剂盒与人乳头瘤病毒基 因分型(39型)检测试剂盒对18种高危型HPV检测结果的具体实验数据统计列表。
[0083] 表 7
[0085] 根据上述阳性符合率和阴性符合率的计算公式以及表7可知，本发明的上述试剂 盒的总阳性符合率为1 〇〇 % ;总阴性符合率为96.67 %。
[0086] 本发明试剂盒与人乳头瘤病毒基因分型（39型)检测试剂盒(PCR-反向点杂交法） 对HPV16检测结果统计将表8,表8为本发明的试剂盒与人乳头瘤病毒基因分型(39型)检测 试剂盒对HPV16检测结果的具体实验数据统计列表。
[0087] 表 8
[0089] 根据表8可知，本发明的上述试剂盒的HPV16阳性符合率为100% ;HPV16阴性符合 率为99.34%。
[0090] 本发明的上述试剂盒与人乳头瘤病毒基因分型(39型)检测试剂盒(PCR-反向点杂 交法)对HPV18检测结果统计见表9,表9为本发明的上述试剂盒与人乳头瘤病毒基因分型 (39型)检测试剂盒对HPV18检测结果的具体实验数据统计列表。
[0091] 表9
[0093] 根据表9可知，本发明的上述试剂盒的HPV18阳性符合率为100% ;HPV18阴性符合 率为100%。
[0094] 本发明试剂盒与人乳头瘤病毒基因分型（39型)检测试剂盒(PCR-反向点杂交法） 对HPV58检测结果统计见表10,表9为本发明的试剂盒与人乳头瘤病毒基因分型(39型)检测 试剂盒对HPV58检测结果的具体实验数据统计列表。
[0095] 表1〇
[0098] 根据表10可知，本发明的上述试剂盒的HPV58阳性符合率为100%;HPV58阴性符合 率为100%。
[0099]本发明试剂盒与人乳头瘤病毒基因分型（39型)检测试剂盒(PCR-反向点杂交法） 对其他15种高危型HPV检测结果统计见表11，表11为本发明的上述试剂盒与人乳头瘤病毒 基因分型(39型)检测试剂盒对其他15种高危型HPV检测结果的具体实验数据统计列表。
[0100]表11
[0102] 根据表11可知，本发明的上述试剂盒的其他15种高危型HPV阳性符合率为100% ; 其他15种高危型HPV阴性符合率为100%。
[0103] 综合上述对比实验结果，本发明的上述试剂盒与对照试剂的检测结果一致性好， 符合准确、有效的原则，完全能够符合临床检测需要。
[0104] 综上所述，本发明提供的检测引物、探针与试剂盒在能够检测18种高危型HPV的同 时，可对HPV16、18和58型进行分型，可以更好的罹患宫颈癌风险的提示效果，更适合中国人 群宫颈癌筛查;本发明的试剂盒只需要单一反应管，检测时间不超过1.5h，具有快速、简便 和高通量的优点，特别适用于大样本检测。
[0105] 以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发 明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括 在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1. 一种检测18种高危型HPV核酸的探针，其特征在于，包括以下序列的探针： 与 HPV26 型、31 型、33 型、35 型、39 型、45 型、51 型、52 型、53 型、56 型、59 型、66 型、68 型、73 型和82型的基因序列互补配对的寡核苷酸序列SEQ ID No:1-15; 与HPV16型的基因序列互补配对的寡核苷酸序列SEQ ID No:46; 与HPV18型的基因序列互补配对的寡核苷酸序列SEQ ID No:49; 与HPV58型的基因序列互补配对的寡核苷酸序列SEQ ID No:52; 与人类β-actin基因的基因序列互补配对的寡核苷酸序列SEQ ID No:55。2. 根据权利要求1所述的检测18种高危型HPV核酸的探针，其特征在于，每组探针分别 在5'端标记报告基团，并在3'端标记淬灭基团； 所述报告基团的最大发射光波长为510-518nm、538_560nm、563-583nm、600nm-6 IOnm、 640_670nm和705_715nm中的任意一种，每组探针标记的报告基团的最大发射光波长不同； 所述淬灭基团的吸收光波长为 380-550nm、470-560nm、480-580nm、550-650nn^P620-730nm 中的任意一种。3. 根据权利要求2所述的检测18种高危型HPV核酸的探针，其特征在于，所述报告基团 S6-FAM、TET、HEX、J0E、VIC、TAMRA、NED、R0X、TexasRed、LCRed610、Cy3、Cy3.5、LC Red640、Cy5、Cy5.5、Quasar670、Quasar705、LC Red705或Alexa Fluor680,所述淬灭基团为 ECLIPSE、DABCYL、TAMRA、BHQl、BHQ2或BHQ3。4. 一种检测18种高危型HPV核酸的引物，其特征在于，包括以下序列的引物： 与 HPV26 型、31 型、33 型、35 型、39 型、45 型、51 型、52 型、53 型、56 型、59 型、66 型、68 型、73 型和82型的基因序列互补配对的寡核苷酸序列SEQ ID No: 16~45; 与HPV16型的基因序列互补配对的寡核苷酸序列SEQ ID No:47~48; 与HPV18型的基因序列互补配对的寡核苷酸序列SEQ ID No:50~51; 与HPV58型的基因序列互补配对的寡核苷酸序列SEQ ID No:53~54; 与人类β-actin基因的基因序列互补配对的寡核苷酸序列SEQ ID No:56~57。5. -种检测18种高危型HPV核酸的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液，所述PCR反应 液包括检测18种高危型HPV核酸的探针和引物，所述探针包括寡核苷酸序列SEQ ID No: 1~ 15、SEQ ID No:46、SEQ ID No:49、SEQ ID No:52和SEQ ID No:55,所述引物包括寡核苷酸 序列SEQ ID No:16~45、SEQ ID No:47~48、SEQ ID No:50~51、SEQ ID No:53~54和SEQ ID No:56~57〇6. 根据权利要求5所述的检测18种高危型HPV核酸的试剂盒，其特征在于，所述引物的 浓度为1〇〇μΜ，引物的用量为2.5yL;所述探针的浓度为100μΜ，寡核苷酸序列为SEQ ID No: 55的探针的用量为0.75yL，其余探针用量为1.5yL。7. 根据权利要求5或6所述的检测18种高危型HPV核酸的试剂盒，其特征在于，所述PCR 反应液还包括IOXPCR buffer、25mM MgCl2、25mM dN(U)TP、lUAxL UNG和纯水。8. 根据权利要求7所述的检测18种高危型HPV核酸的试剂盒，其特征在于，PCR buffer 的体积为125yL，MgCl2的体积为150yL，dN(U)TP的体积为10yL，UNG的体积为5yL，所述PCR反 应液的总体积为I. lmL。9. 根据权利要求5所述的检测18种高危型HPV核酸的试剂盒，其特征在于，还包括热启 动酶，所述热启动酶的浓度为5U/yL。10.根据权利要求5所述的检测18种高危型HPV核酸的试剂盒，其特征在于，还包括阴性 质控品和阳性质控品，所述阴性质控品包括Ing/yL人基因组DNA;所述阳性质控品包括Ing/ yL的人基因组DNA以及1.0\105(3(^68/11^的册￥16、册￥18和册￥58的全基因组质粒的混合 物。
【文档编号】C12R1/93GK105950788SQ201610428231
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】蔡泽加, 杨勇贤, 田洁, 陈永娟, 王晓辉, 卢舟宇
【申请人】亚能生物技术（深圳）有限公司