专利名称：新布尼亚病毒实时荧光rt-pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种在流行病学监控中用于新布尼亚病毒感染诊断依据的新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒。
背景技术：
2007年，河南省信阳、南阳地区发现了多例不明原因发热、严重消化道出血症状，白细胞、血小板减少，并伴出血倾向的病人。河南省疾病预防控制中心对此开展了专项调查，根据临床特点建立疾病定义，扩大搜索范围，建立症状监测报告系统，命名为发热伴血小板减少综合征，多种已知病原体检测阴性，仅极少部分病例人嗜粒细胞无形体核酸、血清学检测阳性，随后湖北、山东、安徽、江苏、辽宁等省也发现了类似病例。2010年河南省新发传染病创新科研团队在发热伴血小板减少综合征病例急性期 血清标本中分离到一种未知病原体，完成了新病毒全基因组测序，结合电子显微镜形态学观察、流行病学和临床特征，确定为布尼亚病毒科白蛉病毒属的一种新病毒，并命名为新布尼亚病毒。新布尼亚病毒属于布尼亚病毒科白蛉病毒属，呈球形，直径80 100 nm,有包膜，表面有棘突，基因组含三个单股负链RNA片段(L、M和S)。可以经接触血液、虫媒等途径传播，对人体致病严重，潜伏期为7 9天，主要临床表现为突然起病、发热、乏力、纳差、恶心、呕吐等；部分病例有头痛、肌肉酸痛、腹泻等症状；体格检查常有颈部及腹股沟等浅表淋巴结肿大伴压痛、上腹部压痛及相对缓脉；部分病例病情危重，出现意识障碍、皮肤瘀斑、消化道出血、肺出血等，可因休克、呼吸衰竭、弥漫性血管内凝血(DIC)等多脏器功能衰竭死亡，病死率较高。该病严重影响了人民群众身体健康，给民众造成了巨大的经济损失和精神负担。因此，针对感染新布尼亚病毒导致的发热伴血小板减少综合征病例提供一种简便、快速、灵敏、特异性高的检测试剂成为目前临床诊断该类病人的迫切需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒可以快速、简便、敏感、特异性的检测发热伴血小板减少综合征病人急性期血清中新布尼亚病毒的存在，为疾病的诊断和流行病学调查提供参考依据。为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案
本发明所述的新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，包括PCR反应酶、PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品和DEPC H2O,所述PCR反应液包括特异性引物和荧光探针，上游引物为5’ - GAARTCCTCAAGCTCAGTCAAATTG _3’，下游引物为5’ -GCAAAGGAGTGATCATGTCIGAGT _3’，荧光探针为5’ -CTGCTGCTCACCAAACTCCACIGCA -3’ ；阳性质控品模板的核苷酸序列为TAAGACAGAGTTCACAGCAGCATGGAGGGGATCCCTGAAGGAGTTGTAAACTTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGCATCTTCACATTGATAGTCTTGGTGAAGGCATCTTGCCATAAAGAGTAAGCCTCCATCAGGGTCTTGGTCGTGGCTTCAGATACCCCTGCAGTTGGAATCAGGGACCCGAAGGCCATGCACATCATCTCAGGGGGATAATTCTCGACCTTCAGGTTCATGACGGCTGGCCCCACAGGGAGATACTCCTTTAAGGCTGCTGCTGCAGCACATGTCCAAGTGGGGAGGCTCTGCGCTACCCTTACTGGGGTGATTGAGAGCCTGGTCTCTGCCCTCTCAACCAGCC
CATATTTCTCCTGGAGTGCCATCAACCTCTTAGACCCTGAGTTTGACATCTTCCCTGATGCCTTGACGATCTTATTG
CCTCGAGTCAGGGCAAAGACAATGATGAACTTAGTATCCTTCACCCAGTCATCTCCACCTGTCTCCTTCAGCTTCTT
GATGATCAAAGCAGGATCAAGGCCTTCATAGGCTAGCTCTCTCGCGAAATCCTCAAGCTCAGTCAAATTGAGCTGCT
GCTCACCAAACTCCACTGCAATTCTGGACCACTCTGACATGATCACTCCTTTGCGTCTTTCCTTTTTTGGGGGTTTo所述阳性质控品模板是含有插入新布尼亚病毒特异性核酸序列的TOCM-T质粒载体，该载体可在大肠杆菌JM109中增殖。荧光探针为寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’ 一 3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，因此特异性和敏感性高，目前已广泛应用于乙肝病毒、人乳头瘤病毒、结核杆菌等多种病原体的临床诊断中。本发明就是采用Taqman探针技术，设计了检测新布尼亚病毒核酸的试剂盒，应用于发热伴血小板减少综合征病例的临床诊断中，获得了很好的检测效果，能够快速、简便、敏感、特异地检测新布尼亚病毒的存在。本发明的优点主要体现在
I、敏感实时荧光定量RT-PCR检测技术是综合了 PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显像技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。2、特异使用特异性引物和探针双重对靶分子进行识别，特异性好、准确性高、假阳性低。3、简便安全操作简单、安全、自动化程度高、防污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染。4、快速速度快，高通量，可在2小时内完成。
图I是本发明所用荧光探针的工作原理，R表示报告荧光基团，Q表示淬灭荧光基团。图2是实时荧光RT-PCR的特异性结果。图3是实时荧光RT-PCR的敏感性结果。
具体实施例方式本发明所述的新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，包括PCR反应酶、PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品和DEPC H2O,所述PCR反应液包括特异性引物和TaqMan荧光探针(荧光探针的荧光基团为FAM,如图I所示)，上游引物为 5’ -GAARTCCTCAAGCTCAGTCAAATTG _3’，下游引物为5’ -GCAAAGGAGTGATCATGTCIGAGT -3’，荧光探针为5’ -CTGCTGCTCACCAAACTCCACIGCA -3’ ；阳性质控品模板的核苷酸序列为TAAGACAGAGTTCACAGCAGCATGGAGGGGATCCCTGAAGGAGTTGTAAACTTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGCATCTTCACATTGATAGTCTTGGTGAAGGCATCTTGCCATAAAGAGTAAGCCTCCATCAGGGTCTTGGTCGTGGCTTCAGATACC
权利要求
1.一种新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，包括PCR反应酶、PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品和DEPC H2O,其特征在于所述PCR反应液包括特异性引物和荧光探针，上游引物为5 ’ - GAARTCCTCAAGCTCAGTCAAATTG _3 ’，下游引物为5 ’ -GCAAAGGAGTGATCATGTCIGAGT _3’，荧光探针为5’- CTGCTGCTCACCAAACTCCACIGCA -3’ ；阳性质控品模板的核苷酸序列为TAAGACAGAGTTCACAGCAGCATGGAGGGGATCCCTGAAGGAGTTGTAAACTTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGCATCTTCACATTGATAGTCTTGGTGAAGGCATCTTGCCATAAAGAGTAAGCCTCCATCAGGGTCTTGGTCGTGGCTTCAGATACCCCTGCAGTTGGAATCAGGGACCCGAAGGCCATGCACATCATCTCAGGGGGATAATTCTCGACCTTCAGGTTCATGACGGCTGGCCCCACAGGGAGATACTCCTTTAAGGCTGCTGCTGCAGCACATGTCCAAGTGGGGAGGCTCTGCGCTACCCTTACTGGGGTGATTGAGAGCCTGGTCTCTGCCCTCTCAACCAGCCCATATTTCTCCTGGAGTGCCATCAACCTCTTAGACCCTGAGTTTGACATCTTCCCTGATGCCTTGACGATCTTATTGCCTCGAGTCAGGGCAAAGACAATGATGAACTTAGTATCCTTCACCCAGTCATCTCCACCTGTCTCCTTCAGCTTCTTGATGATCAAAGCAGGATCAAGGCCTTCATAGGCTAGCTCTCTCGCGAAATCCTCAAGCTCAGTCAAATTGAGCTGCTGCTCACCAAACTCCACTGCAATTCTGGACCACTCTGACATGATCACTCCTTTGCGTCTTTCCTTTTTTGGGGGTTTo
2.根据权利要求I所述的新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述阳性质控品模板是含有插入新布尼亚病毒特异性核酸序列的PUCM-T质粒载体，该载体可在大肠杆菌JM109中增殖。
全文摘要
本发明公开了一用于检测新布尼亚病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，该试剂盒包括PCR反应酶、PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品和DEPCH2O，PCR反应液中包含特异性引物和Taqman荧光探针，该引物和探针是针对布尼亚病毒的基因组相对应的S片段区域设计的，能够快速、简便、敏感、特异地检测新布尼亚病毒的存在。本试剂盒适用于发热伴血小板减少综合征病人急性期血清标本及病原细胞分离培养物等标本的检测，检测结果可作为新布尼亚病毒感染的诊断依据，同时适用于流行病学监控。
文档编号G01N21/64GK102634604SQ20121002518
公开日2012年8月15日 申请日期2012年2月6日 优先权日2012年2月6日
发明者刘国华, 杜燕华, 许汴利, 陈豪敏, 马宏, 黄学勇 申请人:河南省疾病预防控制中心