巴泰病毒实时荧光定量rt-pcr检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及病毒检测领域，具体设及己泰病毒实时巧光定量RT-PCR检测方法及 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 己泰病毒度ataivirus,BATV)是布尼亚病毒科度nuyavirus)布尼亚病毒属 的rthobunyavirus)布尼亚姆韦拉度unyamwera)血清组的成员，主要分布于亚洲和欧洲， W库蚊和按蚊为主要传播媒介，具有广泛的动物宿主，感染后可引起人类发热和病毒性脑 炎症状。己泰病毒于1955年首先分离自马来西亚的库蚊，随后陆续在欧亚的多个国家和地 区的多种昆虫和哺乳动物中也分离到该病毒，并在人、马、牛等家畜血清中检测到该病毒抗 体。我国于1998年首次从云南省的菲律宾按蚊种分离到一株己泰病毒，且该病毒在当地发 热病人中的抗体阳性率为4. 17%。
[0003] 目前，对BATV的检测主要采用病毒分离和病毒核酸的普通PCR检测。病毒分离耗 时且对标本质量要求高，普通PCR快捷特异，但易造成污染且检测敏感性低。
[0004] 本发明所建立的针对BATV的检测方法是基于RNA为模板的一步法化qman Real-timePCR，是一种利用反应体系中实时巧光信号的动态变化，最终通过标准曲线对未 知模板进行定量分析的方法。可直接用于多种被检标本提取RNA后的直接检测，不仅缩短 了检测时间、实现了对模板的定量、具有更高的灵敏度和特异性，且自动化程度高、低污染， 更避免了病毒分离培养中因细胞传代老化敏感性下降和因病毒的无CPE增殖现象所产生 的实验误差。为今后进一步开展BATV的分布监测、临床诊断及其相关研究提供了快速便捷 的技术手段。
【发明内容】
阳0化]根据本发明的己泰病毒实时巧光定量RT-PCR检测用引物对，包括：
[0006] 己泰病毒上游引物：BATV-F-NS:5' -TCTCGCAAAAAGAAGTGAATGG-3' ；
[0007]下游引物：BATV-R-NS:5'-TGGCAAGGAATCCACTGAGTCT-3，。
[0008] 根据本发明的己泰病毒实时巧光定量RT-PCR检测用探针，其序列如SEQIDNo. 3 所示：
[0009] haMan探针：BATV-Probe-NS:FAM 5,-CCAGTTCCAGACGATGGTCTTACCCTCC-3,（沈Q IDNo. 3)TAMRA，其5'端标记FAM巧光报告基团、3'端标记TAMRA巧光泽灭基团。
[0010] 本发明所提供的引物和化qMan探针，是根据己泰病毒S片段最为保守的保守区域 设计的，既可用于检测己泰病毒，也可用于定量检测样本中己泰病毒的核酸拷贝数。
[0011] 根据本发明的己泰病毒实时巧光定量RT-PCR检测方法包括使用W下引物、探针 对待检测样本进行PCR扩增的步骤，
[0012] 己泰病毒上游引物：BATV-F-NS:5' -TCTCGCAAAAAGAAGTGAATGG-3' ；
[0013] 下游引物：BATV-R-NS:5' -TGGCAAGGAATCCACTGAGTCT-3，，
[0014]haMan探针：BATV-Probe-NS:FAM5,-CCAGTTCCAGACGATGGTCTTACCCTCC-3,（沈Q IDNo. 3)TAMRA，其5'端标记FAM巧光报告基团、3'端标记TAMRA巧光泽灭基团。
[0015] 根据本发明的己泰病毒实时巧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括：
[0016] 己泰病毒上游引物：BATV-F-NS:5' -TCTCGCAAAAAGAAGTGAATGG-3' ；
[0017] 下游引物：BATV-R-NS:5' -TGGCAAGGAATCCACTGAGTCT-3，， 阳0化]haMan探针：BATV-Probe-NS:FAM5,-CCAGTTCCAGACGATGGTCTTACCCTCC-3,（沈Q IDNo. 3)TAMRA，其5'端标记FAM巧光报告基团、3'端标记TAMRA巧光泽灭基团。
[0019] 己泰病毒25uL实时巧光定量RT-PCR检测反应体系，包括：2XReaction Mixl2. 5yL、EnzymeMixlyUlOyM上下游引物与 5yM探针各lyURNA模板lyL、 Nuclease-freewater7.SuL。
[0020] 己泰病毒实时巧光定量RT-PCR检测反应体系的最佳扩增条件为：先45°ClOmin; 然后95°ClOmin;最后95°C15s和60°C60s40个循环。所述己泰病毒实时巧光定量RT-PCR 检测反应体系适用于所有巧光定量PCR反应仪。
[0021] 本发明具有W下优点：
[0022] 1、首次建立了己泰病毒实时巧光定量RT-PCR检测方法，检测方法可W直接用于 任何标本提取核酸后的己泰病毒定量检测。 阳023] 2、本发明与其他己泰病毒检测方法相比，灵敏度更高，操作更加简便且可有效防 止污染，检测结果更加直观准确，使检测效率得到很大提高。
[0024] 3、本检测方法不仅能够快速评价标本中己泰病毒的感染状况，同时也为该病毒在 与疾病关系方面的进一步研究提供了有效工具。
[0025] 综上所述，本发明的目的就是利用化qMan Real-time PCR技术建立了专口针对己 泰病毒的特异、快捷，更加敏感、有效的分子检测方法。通过序列比对挑选出己泰病毒基因 组中S片段上高度保守的序列，在此序列上设计一对引物及一条化qMan探针，建立实时巧 光定量RT-PCR反应体系，进行体系的特异性与稳定性验证。本发明方法为今后进一步开展 BATV的分布监测、临床诊断及其相关研究提供了快速便捷的技术手段，从而更好地了解该 病毒。
【附图说明】
[0026] 图1为对己泰病毒的特异性检测的扩增曲线；
[0027]图2为己泰病毒实时巧光定量RT-PCR检测灵敏度的病毒基因拷贝数定量分析标 准曲线；
[0028] 图3显示己泰病毒实时巧光定量RT-PCR检测灵敏度定量分析标准曲线。
【具体实施方式】 阳〇29] 实施例1 W30] 本发明所建立的针对己泰的检测方法是基于RNA为模板的一步法化qman Real-timePCR，是一种利用反应体系中实时巧光信号的动态变化，最终通过标准曲线对未 知模板进行定量分析的方法。可直接用于多种被检标本提取RNA后的直接检测。本发明还 设及上述检测方法建立所包含的所有内容。
[0031] 该方法具体步骤为：
[0032] (1)引物与探针的设计 阳03引化qMan PCR引物、探针序列信息见表1。
[0034] 表1 BATV检测体系特异引物与探针序列信息
[0035]
[0036] 似巧光素的选择
[0037] 巧光发射基团选用较为常用的FAM基团，巧光泽灭基团选用TAMRA基团。 阳〇3引（3)引物与探针的合成
[0039]引物由北京梓熙生物科技有限公司合成，探针由上海生工生物工程有限公司合成 并标记，探针5'端标记FAM巧光报告基团、3'端标记TAMRA巧光泽灭基团。
[0040] (4)样品