度为 Ig/lOOmL或lOg/lOOmL、己醇的体积浓度优选为40%或60% ;
[021引洗液A中的高氯酸钢的浓度为lOg/100血或30g/100血，醋酸钢的浓度为 4g/100mL或15g/100mU己醇的体积浓度为35%或50% ;
[0219] 洗液B为体积浓度40 %或80 %的己醇。
【主权项】
1. 一种人乳头瘤病毒的核酸检测试剂盒，其特征在于，包括：核酸扩增试剂； 其中，所述核酸扩增试剂包括：引物对、与引物对相对应的探针； 所述引物对包括：如 SEQ ID NO. 1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、17-18、 19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30、31-32、33-34、35-36、37-38、39-40、41-42、 43-44、45、46、47-48 所示的引物对和如SEQIDN0.73-74 所示的内标引物对； 所述与引物对相对应的探针包括：与如SEQ ID NO. 1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、 13-14、15-16、17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30、31-32、33-34、35-36、 37-38、39-40、41-42、43-44、45、46、47-48 所示的引物对分别相对应的如 SEQ ID NO. 49-72 所示的探针，以及如SEQ ID NO. 75所示的内标探针。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述探针的5'端和3'端还分别连接有荧 光基团和淬灭基团；所述引物对中的引物浓度为80~140nmol/L ;所述探针的浓度为20~ 50nmol/L ； 所述核酸扩增试剂还包括：HPV反应液A、Hotstart Taq酶和UNG酶； 所述HPV反应液A是通过盐缓冲液将MgCl2和dNTPs溶解而形成的，其中，MgCl2在HPV 反应液A中的终浓度为130mM~200mM，dNTPs在HPV反应液A中的终浓度为0. 15mM~ 0. 5mM，盐缓冲液是含 20mM ~40mM pH8. 8Tris-HCl、50 ~55mM KC1 的水溶液。3. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述探针中，如SEQ ID NO. 49-72所示的 探针的5'端的荧光基团包括：FAM、HEX、CY5或ROX ; 如SEQ ID NO. 49-72所示的探针3'端的淬灭基团包括：BHQ1或BHQ2 ; 内标探针的5'端标记有TAMARA荧光基团，3'端标记有BHQ1或BHQ2淬灭基团。4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述探针中，如SEQ ID NO. 51-52、69-72 所示的探针的5'端标记有FAM、R0X或CY5荧光基团，3'端标记有BHQ1或BHQ2淬灭基团； 如SEQ ID NO. 49-50、53-68所示的探针的5'端标记有FAM、R0X、CY5或HEX荧光基团， 3'端标记有BHQ1或BHQ2淬灭基团。5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述探针中，如SEQ ID NO. 49、51、53所 示的探针的5'端使用R0X荧光基团标记； 如SEQ ID NO. 50、52、54所示的探针的5'端使用CY5荧光基团标记； 如SEQ ID NO. 57、62所示的探针的5'端使用HEX荧光基团标记； 如SEQ ID NO. 55-56、58-61、63-72所示的探针的5'端使用FAM荧光基团标记； 如SEQ ID NO. 49-72、75所示的探针的3'端使用BHQ1淬灭基团进行标记。6. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：核酸提取试剂、HPV 型别的阳性对照品和阴性对照品。7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸提取试剂包括：磁珠悬浮液； HPV型别的阳性对照品是由HPV6、11、16、42、18、52、58、31、33、45或53型别临床样本配 制的浓度为5X 104拷贝数/ml的阳性对照品； 阴性对照品是由HPV病毒阴性的脱落宫颈细胞保存液配制为阴性对照品。8. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述磁珠悬液是顺磁性氧化硅纳米磁珠 的悬浮液； 所述核酸提取试剂还包括以下组分： 1) 裂解液：其是含异硫氰酸胍和TritonX-100的溶液，或者该裂解液是含异硫氰酸 胍和Tween-20的溶液；其中，裂解液中的异硫氰酸胍的浓度为2M~6M，TritonX-ΙΟΟ或 Tween-20的体积浓度为1 %~2% ; 2) 结合液，其是含高氯酸盐、醋酸盐和有机溶剂的水溶液；其中，高氯酸盐包括：高 氯酸钠；醋酸盐包括：醋酸钠；有机溶剂包括：乙醇；高氯酸盐的浓度为17g/100mL~ 30g/100mL，醋酸盐的浓度优选为lg/100mL~10g/100mL，有机溶剂的体积浓度为40%~ 60% ； 3) 洗液A，其是含高氯酸钠、醋酸盐和乙醇的水溶液，其中，醋酸盐包括：醋酸钠；高氯 酸钠的浓度为l〇g/l〇〇mL~30g/100mL，醋酸盐的浓度为4g/100mL~15g/100mL，乙醇的体 积浓度为35 %~50% ; 4) 洗液B，其为体积浓度40 %~80 %的乙醇； 5) 洗脱液，其为 10 ~20mM pH8. 0 的 Tris-HCl ; 6) 蛋白酶K ; 7. RNA的聚合酶A。9. 一种利用人乳头瘤病毒的核酸检测试剂盒检测人乳头瘤病毒的方法，其特征在于， 包括步骤： 1) 样本的核酸提取 利用权利要求6所述的核酸提取试剂，对宫颈脱落细胞样本进行核酸提取，得到PCR模 板； 2) 试剂配制 HPV 荧光反应液 B1:SEQ ID NO. l-2、3-4、19-20、27-28、73-74所示的引物对和SEQID NO. 49、50、58、62、75所示的探针；各对引物浓度为80-140nmol/L，探针浓度为20-50nmol/ L ； HPV荧光反应液B2 :SEQ ID NO. 9-10、11-12、17-18、13-14、15-16、35-36、21-22、23-24、 29-30、25-26、31-32、39-40、33-34、37-38、73-74所示的引物对和SEQIDN0·53、54、57、55、 56、66、59、60、63、61、64、68、65、67、75 所示的探针；各对引物浓度为 80-140nmol/L，探针浓 度为 20_50nmol/L ; HPV 荧光反应液 B3 :SEQ ID Ν0·5-6、7-8、41-42、43-44、45-46、47-48、73-74 所示的引 物对和SEQID NO. 51、52、69、70、71、72、75所示的探针；各对引物浓度为80-140nmol/L，探 针浓度为20-50nmol/L ; 然后，在分别含有3~5μ 1 HPV荧光反应液B1、B2、B3的每管中，加入14~16μ 1权 利要求2所述的HPV反应液A、Hotstart Taq酶3~7U/次检测和UNG酶0. 1~0. 5U/次 检测，形成混合液； UNG酶，在开始PCR扩增反应的第一次变性步骤之前，进行37~50°C保温1~10分 钟； 3. PCR扩增 将步骤1)得到的PCR模板加入到步骤2)中的混合液中，进行PCR扩增反应，并且权利 要求6所述的阳性对照品与阴性对照品与样本同时进行PCR扩增反应； 其中，PCR扩增方法包括： I、 37~50°C保温2~5min，1个循环； II、 94 ~95°C下 1 ~lOmins，1 个循环； III、 94~95°C下10~60s的变性步骤，50~65°C下10~60s的退火步骤，65~72°C 下30~90s的延伸步骤，反复进行40~50个循环； 4)在65~72°C下，将步骤3)得到的PCR扩增反应产物进行荧光检测，并根据靶标扩 增曲线的Ct值及内标扩增曲线的Ct值的变化确定HPV的型别感染情况。10. -种如权利要求1~8中的任一项所述的试剂盒在检测低危型和高危型人乳头瘤 病毒中的应用以及所述试剂盒在对人乳头瘤病毒进行分型中的应用，其特征在于：所述低 危型人乳头瘤病毒包括：HPV6型、HPV11型、HPV40型、HPV42型、HPV43型和HPV44型； 高危型人乳头瘤病毒包括：HPV16型、HPV18型、HPV52型、HPV58型、HPV31型、HPV33 型、HPV45 型、HPV26 型、HPV35 型、HPV39 型、HPV51 型、HPV53 型、HPV56 型、HPV59 型、HPV66 型、HPV68 型、HPV73 型和 HPV82 型； 所述试剂盒在对人乳头瘤病毒进行分型中的应用中，包括：对HPV6型和HPV11型进行 分型，以及对HPV16型、HPV18型、HPV52型、HPV58型、HPV31型、HPV33型和HPV45型进行 分型。
【专利摘要】本发明公开了一种人乳头瘤病毒的核酸检测试剂盒及其使用方法和应用，该试剂盒包括：核酸扩增试剂；核酸扩增试剂包括：引物对、与引物对相对应的探针；该试剂盒的使用方法包括：1)样本的核酸提取；2)试剂配制；3)PCR扩增；4)在65～72℃下，将步骤3)得到的PCR扩增反应产物进行荧光检测，并根据靶标扩增曲线的Ct值及内标扩增曲线的Ct值的变化确定HPV的型别感染情况。该试剂盒可应用于检测低危型和高危型人乳头瘤病毒以及该试剂盒在对人乳头瘤病毒进行分型中的应用。该本试剂盒具有能对HPV相对病毒载量进行推算、避免污染、提高样本处理通量、避免检漏等优点。
【IPC分类】C12R1/93, C12Q1/68, C12Q1/70
【公开号】CN105506173
【申请号】CN201410497119
【发明人】邓明文, 张健, 孟影, 顾颖慧
【申请人】苏州新波生物技术有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年9月25日