Lyrm2基因及其表达产物的新用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物医药领域，具体设及LYRM2基因及其表达产物的新用途，更具体的 设及LYRM2基因及其表达产物在检测骨质疏松中的新应用。
【背景技术】
[0002] 骨质疏松症是一种W低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨质脆性增加和易 于骨折的代谢性骨病。骨质疏松症后果严重，是老年人群致死、致残的常见原因。发生骨折 后大多数的老年病人都存在慢性疼痛，永久的残疾，失去独立生活的能力，严重降低了生活 质量;椎体骨折也常致背痛、身体崎形，身高缩短、驼背甚至残疾。此外，骨质疏松症医疗费 用高，由其引起的骨折导致巨大的医疗资源占用，给社会带来沉重负担。鉴于骨质疏松症所 带来的严重后果和社会经济负担及医疗资源的占用已经随社会的进步而日益明显，迫切需 要寻找新的解决途径。科研工作者已经在尝试从分子生物学的角度寻找骨质疏松致病机 理，并取得一定进展，研究表明骨质疏松症之所W出现特征性的低骨矿物密度(BMD)，主要 原因是由于出现了不平衡的骨吸收和骨形成体系，也即破骨细胞骨吸收程度超过了成骨细 胞作用的骨形成程度，免疫系统与骨代谢也具有很强的关联，特别是外周血单核细胞直接 参与了破骨细胞形成。它们是破骨细胞的前体细胞，并分泌破骨细胞诱导因子。对人类自身 的研究显示:外周血单核细胞中特定基因的表达水平和骨质疏松症密切相关。但是，目前人 们对于骨质疏松症病因研究方面任然不是很清楚，相关的研究成果也十分匿乏。
[0003] 为解决目前骨质疏松分子标记物稀缺的问题，发明人对9例骨质疏松外周血样本 及6例健康人对照外周血样本进行高通量测序，结合生物信息学方法分析进行致病祀点基 因的筛选，挑选出候选基因 LYRM2,进一步，通过实验证实了 LYRM2基因与骨质疏松具有很好 的相关性，同时设计了针对LYRM2的高效干扰RNA。本发明提供的骨质疏松辅助诊疗祀点具 有很好的临床应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供LYRM2基因和/或其表达的蛋白在制备抗骨质疏松制剂和/ 或骨质疏松诊断制剂中的应用。
[0005] 本发明的目的在于提供检测LYRM2基因和/或其表达蛋白的制剂在制备骨质疏松 诊断制剂中的应用。
[0006] 进一步，所述的骨质疏松的诊断制剂包括用巧光定量PCR方法、基因忍片方法检测 外周血中LYRM2基因和/或LYRM2蛋白的表达。
[0007] 巧光定量PCR法是通过巧光染料或巧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记 跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可W对产物进行分析，计算待测样品模板的 初始浓度。巧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。 多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复 性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
[000引基因忍片又称为DM微阵列化ΝΑ microarray)，可分为Ξ种主要类型：1)固定在聚 合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的祀 基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列， 通过与巧光标记的祀基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核巧酸探针 阵列，与巧光标记的祀基因杂交进行检测。基因忍片作为一种先进的、大规模、高通量检测 技术，应用于疾病的诊断，其优点有W下几个方面:一是高度的灵敏性和准确性;二是快速 简便;Ξ是可同时检测多种疾病。
[0009] 所述的用于巧光定量PCR方法检测骨质疏松中LYRM2基因的产品含有一对特异性 扩增LYRM2基因的引物;所述的基因忍片包括与LYRM2基因的核酸序列杂交的探针。
[0010] 进一步，所述的骨质疏松的诊断制剂包括用免疫方法检测LYRM2蛋白的表达。优选 所述免疫检测方法检测骨质疏松中LYRM2蛋白表达的为western blot和/或化ISA和/胶体 金检测方法。
[0011] 酶联免疫吸附实验化LISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标 记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体 等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作 步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测I gM抗体、应用亲和素和 生物素的化ISA。化ISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶化RP)或者碱性憐酸 酶(AP)。
[0012] 常用的免疫胶体金检测技术：（1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切 片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，W银显影液增强标记， 使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。（2)免疫 胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合， 然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。（3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作 载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涂后用胶体金标记的抗体检测相应 的抗原或抗体。（4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体W条带状固定在膜上，胶体金 标记试剂(抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上 后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的 抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集 在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。
[0013] 进一步，所述检测LYRM2蛋白的化ISA法为使用化ISA检测试剂盒。所述试剂盒中的 抗体可采用市售的LYRM2单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括:包被LYRM2单克隆抗体的 固相载体，酶标二抗，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涂液，酶反应终止液 等。
[0014] 进一步，所述检测LYRM2蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市 售的LYRM2单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体 金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区（T)喷点有抗LYRM2 单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0015] 本发明的目的在于提供一种检测骨质疏松的巧光定量PC时式剂盒，其特征在于，所 述试剂盒检测基因 LYRM2，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 9， 下游引物序列为SEQ ID NO. 10。
[0016] 进一步，该PC时式剂盒适合于目前存在市场上的所有类型巧光定量基因扩增仪，灵 敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[0017] 进一步，上述巧光定量PC时式剂盒组分包括:特异性引物、内参引物、巧光定量PCR 反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.9， 下游引物序列为SEQ ID NO. 10。所述内参引物为β-actin内参引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 11，下游引物序列为沈Q ID NO. 12。
[001引所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。优选TR虹ol?Reagent进行样本RNA提取。
[0019] 本发明目的是提供了一种骨质疏松检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测LYRM2蛋 白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
[0020] 本发明目的是提供了一种检测骨质疏松的基因忍片，所述的基因忍片包括与 LYRM2基因的核酸序列杂交的探针。
[0021] 本发明的目的在于提供LYRM2基因和/或其蛋白抑制剂在制备抗骨质疏松制剂中 的应用。
[0022] 为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基 因 LYRM2，继而通过分子生物学方法验证了 LYRM2与骨质疏松的关系:LYRM2与骨质疏松具有 很好的相关性，可用于制备抗骨质疏松制剂和/或骨质疏松诊断制剂，具有重要的临床应用 价值。
[0023] 进一步，所述抗骨质疏松制剂是指可W抑制LYRM2基因的表达的制剂。本领域人员 熟知抑制基因的表达通常可W采用下述方法中的一种和/或几种:通过激活LYRM2基因的抑 制基因、激活LYRM2基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技术抑制LYRM2基因表达、激 活促进LYRM2基因 mRNA降解的microRNA、导入促进LYRM2基因编码蛋白降解的分子、抑制促 进LYRM2基因表达的因子及蛋白的表达。即通过激活LYRM