2基因的抑制基因、激活抑制LYRM2 基因表达的蛋白、导入抑制LYRM2基因表达的SiRNA、激活促进LYRM2mRNA降解的microRNA、 导入促进LYRM2蛋白降解的分子、抑制促进LYRM2基因表达的因子及蛋白的表达。
[0024] RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源祀基因的mRNA 特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断体内 某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。S iRNA设计 完成后可W采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可W通过憐酸巧共沉 淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体 试剂法等途径转染细胞。
[0025] 进一步，所述抑制LYRM2基因表达的siRNA序列选自下列序列中的一种和/或几种： 沈910顯.1、沈910顯.2、沈910顯.3、沈910顯.4、56910側.5、56910側.6。优选 siRNA序列为沈Q ID NO. 1、SEQ ID NO.2和沈Q ID NO.5、SEQ ID NO.6。
[0026] 本发明的目的在于提供一种抗骨质疏松制剂，所述抗骨质疏松制剂抑制LYRM2基 因的表达。进一步，所述的抗骨质疏松制剂中含有抑制LYRM2基因表达的SiRNA。
【附图说明】
[0027] 图1是LYRM2基因在骨质疏松外周血及健康人外周血中相对表达量图
[002引图2是RNA干扰后各组LYRM2mRNA相对表达水平图：C组：空白对照组;Cl组:转染脂 质体组;C2组:转染非特异性的siRNA组;S1，S2，S3组:转染特异性的siRNA组。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可W理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 W对运些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。
[0030] 实施例1高通量测序及分析
[0031] 分别收集9例骨质疏松患者外周血样本及6例健康人外周血样本，进行RNA提取， RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可W初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否 可W用于进一步的转录组分析。进而通过化no化oplOOO分光光度计检测RNA样品的提取情 况，3臟-369测序的样品要求:00260/00280为1.8-2.2。
[0032] 测序平台为Illumina公司的化Seq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度 测序，测序后我们运用 Fast-QC 化 ttp: //ww. bioinf ormatics. babraham. ac.址/pro jects/ fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分 布，GC含量，PCR dup 1 i cat ion含量，kmer的打equency等。在差异基因表达分析时，根据得到 的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，L0G2FO1或<-l，FDR< 0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene化logy和信 号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于W上数据 分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达基因 LYRM2。
[0033] 实施例2骨质疏松患者外周血及健康人外周血中LYRM2基因表达情况
[0034] -材料和方法
[0035] 1、材料
[0036] 收集74例骨质疏松患者外周血及46例健康人外周血，对其进行分组及编号。
[0037] 2、方法
[003引2.1骨质疏松外周血及健康人外周血总RNA的提取
[0039] 采用Τ?Ι.Ιζο憾Reagent进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行。
[0040] RNA质量判定标准:RNA样本的0D260/0D280值为1.8-2.2之间；总3魁电泳图谱有清 晰的28S、18S条带;70°C水浴保溫1小时后的电泳图谱与水浴保溫前的图谱无明显差异。 [0041 ] 2.2逆转录合成〇0臟
[0042] 采用S呼灶妨ript磨III Reverse TranscriptaseQnvitrogen，货号 18080-044)进 行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
[0043] 使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对bg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μ1 反应体系，每个样品取化g总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入W下组分：
[0044] 5X逆转录缓冲液扣iaOmmol/1 dNTP 1.2扣l，0.1mmol/l DTT 2.5μ1，30μπιπιο1/ lOligodT 2μ1，20〇υ/μ1 MMLV 1.2扣1，模板RNA化g，加入灭菌水至总体系25μ1η42°(3解育1 小时，72°C10分钟，短暂离屯、。cDNA保存放-20°C冰箱备用。
[0045] 2.3Real-Time PCR
[0046] 2.3.1仪器及分析方法
[0047] 用ABI 7500型巧光定量PCR仪，采用2-AACT法进行数据的相对定量分析。
[004引 2.3.2引物设计
[0049]采用在线引物设计软件，模板序列为醒_020466,引物设计后由invi化ogen公司合 成。具体引物序列如下：
[(K)加]表1引物序列
[0化1 ]
[0化2]操作过程如下：
[0053](一）反应体系：用Power SYBR:!/Green PCR Master Mix( invitrogen，货号 4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为:95° 10min，（95°C15sec，55°C 60sec) X45个循环。
[0054] 表2RealTime反应体系
[0化5]
[0化6](二）样品 RealTimePCR 检测
[0057]将各样品cDNA 10倍稀释后取化1作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进 行扩增。同时在60-95°C进行溶解曲线分析。
[0化引二实验结果
[0059] 实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效 率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高;样本扩增产物溶 解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增;根据qRT-PCR的相对定量公式，比 较LYRM2基因在骨质疏松患者外周血和健康人外周血中的表达水平。结果显示（具体见图 1): qRT-PCR扩增结果稳定，其中LYRM2在骨质疏松外周血中的表达水平高于健康人外周血 中的表达水平，前者是后者的近Ξ倍，W上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析 LYRM2在骨质疏松患者外周血中高表达的结果。
[0060] 实施例始田胞系MG-63的培养
[0061 ] 一、材料
[0062]细胞系MG-63购自中科院上海细胞研究所。
[00创二、主要溶液
[0064] 细胞培养液:DMEM培养基+10%标准胎牛血清。
[0065] 0.25%膜蛋白酶消化液:0.25g膜蛋白酶加入100ml去离子水中，滤器过滤灭菌，分 装备用。
[0066] Ξ、细胞传代
[0067] 1将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去，加入0.25 %膜蛋白酶液1ml，覆盖细 胞层，瓶口消毒，加盖；
[0068] 2倒置显微镜下观察细胞变化，随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，细 胞间质回缩，细胞间隙加大，在还未漂起时将膜酶弃去，加入5ml含10%胎牛血清的培养液 终止消化；
[0069] 始田胞计数:取上述细胞悬液0.5ml，适当稀释后滴入血细胞计数板内，按白细胞计 数法数四角四大格内细胞总数，计数时仅计数细胞核和细胞浆完整的细胞，成堆的细胞按 一个细胞计算，将4大方格内的细胞总数按下列公式换算成每毫升细胞悬液中的细胞数:细 胞总数/ml = 4大格细胞总数/4 X 104 X稀释倍数；
[0070] 4根据细胞计数结果，用DMM完全培养液进一步稀释为每毫升含3 X 105