一种检测青春型精神分裂症易感性的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及检测精神分裂症易感基因检测领域，具体涉及到一种检测青春型精神分裂症易感性的试剂盒。
【背景技术】
[0002]精神分裂症(schizophrenia)是一种慢性、严重性、致残性脑病，严重危害人体健康。是精神类疾病中最严重的一种精神疾病，2009年根据柳叶刀调查显示，我国的精神分裂症患者人数近1000万。精神分裂症需要终身治疗，治疗成本高昂，据统计，美国2002年精神分裂症的治疗总成本达627亿美元，其中直接成本227亿美元，因自杀而早夭和家属因照顾患者而导致的损失等为324亿美元，且精神分裂症具有高致残性，大多数精神分裂症患者会终身残留某些症状，需要终身治疗，由于精神分裂症的严重性和慢性化，对患者、家庭及社会影响很大，消耗大量公共资源，因此精神分裂症已经给社会和家庭带来严重的负担。
[0003]精神分裂症在男性、女性中的发病率几乎相同，但男性发生较早，发生在青春期晚期和成年早期，约在15-25岁起病，而此阶段正是构筑人生道路的关键时期，女性主要在20-35岁起病。患者有幻觉、妄想、自发运动增多等阳性症状，有情感冷漠、言语减退、社交退缩等阴性症状，同时有认知功能缺损，抑郁，社会职业功能损害等认知损伤等症状。
[0004]根据精神分裂症不同临床表现、发病形式、临床特点、病程、治疗方案、治疗反应及预后等因素，可以把精神分裂分为单纯型、偏执型、青春型、紧张型、未分化型及残留型。
[0005]青春型精神分裂症在精神分裂症患者中，比例约占20%左右;常发病于青春期，急骤，病程发展较快，症状显著，内容荒谬。其临床表现以兴奋冲动、异常古怪及意向倒错为主，精神症状丰富易变，情感喜怒无常。以阳性症状为主的青春型，早期治疗效果较好。
[0006]—个世纪以来，人们对精神分裂症的生理、生化、影像、药物治疗以及社会家庭、环境等方面观察，对精神疾病的发病机理做出了各种假说和判断，随着科技进步，人们越来越认识到基因缺陷是许多严重精神疾病产生的重要原因，当人们遇到环境压力时，那些携带疾病易感基因的人比不携带易感基因的人更可能患精神卫生疾患，经调查研究，精神分裂症是遗传度很高的多基因病，主要呈现家族聚集，一旦一个家族成员患病，这个家庭的其他成员携带的易感基因远远高于正常人，需要进行有效的预防与治疗，在科技日益发展的今天如何对待精神分裂症，如何从遗传角度检测易感基因以及个体的疾病易感性，从而进行进一步风险预测和诊断，药物开发，成为广大科技人员和医疗卫生人员面临的严峻问题，尽管国内外易感基因研究开展多年，但是进展缓慢，只有少数关于鉴定遗传易感基因的报道，但是没有具体针对某种类型的精神分裂症的检研究，国际上把精神分裂症分为五种类型，每种类型涉及的易感基因都不一样，不能笼统的用一种或者几种基因把这五种类型都鉴定，这样必然专一性差。而且即使诊断出精神分裂症，但是不知道是哪种类型的精神分裂症，对后续的治疗缺之指导意义。
[0007]利用遗传标记对治病基因进行检测，是近几年来发展的技术。遗传标记，即在染色体上有一段特异DNA序列片段，且有多态性，在世世代代传递中，遵循规律为分离、独立分配和连锁规律，因此可获得遗传物质传递信息。遗传标记可以把基因组分为不同区域，通过连锁和关联分析可获得致病基因所在染色体区域，可对该病基因进一步进行克隆。对于各种不同疾病，寻找致病基因和分析是研究的关键之一。
[0008]第三代遗传标记一SNP(single nucleotide polymorphism)指基因组中某特定核苷酸的位置上会存在两种或两种以上的不同碱基，在群体中最小等位基因频率2 1%。人类的基因组中多数SNP位点仅存在2种等位基因，所以通常SNP会指在特定位置上，某一核苷酸出现双等位基因的改变。SNP是人类基因组计划走向应用的非常重要方法。主要因为SNP提供一个非常有力的工具，用于高危人群的发现、疾病易感基因的鉴定、药物设计和基础生物学研究等。因为人类大量存在SNP位点，提供了更多的机会发现基因与疾病间的关系。通过SNP发现疾病相关基因的突变要比家系等研究容易。某些SNP并不是致病基因，但它可能与某些相邻的致病基因连锁，也同样为重要标记。
[0009]最近基因组扫描结果提示，11号染色体与青春型精神分裂症易感性相关联，但至今在该染色体区域内未发现确定特异的与青春型精神分裂症相关的易感基因。本发明第一次利用SNP技术对青春型精神分裂症易感基因进行检测，为青春型精神分裂症的深入研究和防治、诊断、治疗提供了新的思路。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一种检测青春型精神分裂症易感基因的试剂盒，从而满足本领域对于正确识别青春型精神分裂症易感基因的需求，为青春型精神分裂症的深入研究、预防、治疗、诊断提供了新的思路。
[0011]发明人通过研究结果表明，11号染色体DRD2基因位于llq23，全称是多巴胺D2受体基因，是青春型精神分裂症的易感基因，通过对DRD2基因的SNP位点:rsl800497进行分析，结果显示，rsl800497与青春型精神分裂症高度相关。
[0012]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0013]—种检测青春型精神分裂症易感性的试剂盒，包括:
[0014]I)引物:扩增DRD2基因rsl800497多态性的引物分别为:
[0015]ACGTTGGATGTGTGCAGCTCACTCCATCCT
[0016]ACGTTGGATGCAACACAGCCATCCTCAAAG
[0017]2)PCR扩增缓冲液，Taq聚合酶，
[0018]3)限制性内切酶TaqI和相应的缓冲液。
[0019]具体研究过程如下:
[0020]1、通过查阅文献、利用计算机互联网及生物信息学获取各方面精神分裂症候选基因研究，在11号染色体通过连锁不平衡分析方法进行单个核苷酸多态性(SNP)连锁不平衡分析，通过NCBI(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/mapviewer)数据库，获得DRD2基因，并通过http://www.ncb1.nlm.nih.gov/SNP,http://snp.cshl.0rg/数据库，搜索出符合其条件的候选基因SNPs。
[0021]2、然后本研究以320例青春型精神分裂症和380例健康对照为研究对象。所有研究对象均为中国汉族人，并且精神分裂症患者要符合ICD-10和CCMD-11-R的诊断标准。
[0022]3、在征得受试者知情同意的情况下，采集外周静脉血，采用Promega(USA)液体纯化提取DNA试剂盒，提取基因组DNA。通过测0D260、0D280的值，再通过公式计算DNA的纯度和含量。DNA 纯度=0D260/0D280。
[0023]4、依据相应的碱基序列合成引物，设计引物:
[0024]ACGTTGGATGTGTGCAGCTCACTCCATCCT
[0025]ACGTTGGATGCAACACAGCCATCCTCAAAG
[0026]5、PCR扩增目的片段
[0027]应用以上引物进行PCR扩增，PCR反应体系为20uL，其中含1mM Tris-HCl(PH8.4)，50mM KCl ,1.5mM MgC12，200uM (1见13，上下游引物各0.411]\^39聚合酶11]，0嫩模板30-50即，PCR扩增条件为:1、94°C5min，2、96°C45s，60°C60s，72°C60s 3个循环，3、95°C45s，59°C65s，72°C60s 5个循环，4、94°C45s，57°C60s，72°C60s，32个循环，5、72°C10min，取PCR产物5uL，
用1.5%琼脂糖凝胶电泳，以DNAmarker为分子量标准品，扩增。
[0028]6、限制性内切酶酶切鉴定基因型
[0029]酶切反应体系为20uL，其中1uLPCR产物，限制性内切酶TaqI 0.5uL，酶切缓冲液2uL，置37°C度温箱4小时，经3%琼脂糖凝胶电泳，根据酶切图谱判定基因型。
[0030]7、结果判定
[0031]rsl800497碱基为(T)的个体为精神分裂症易感人群。
[0032]由于基因多态性，导致限制性内切酶酶切位点改变、消失或产生新的位点，若用某中限制性内切酶酶切基因组DNA，则酶切后产生与正常基因组不同长度的DNA片段，经用酶切检测，可检测到这些条带位置和大小。聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)方法原理为:在设计PCR扩增实验时，引物位于基因多态性部位的两侧，将目的基因扩增，使其易于检测，由于多态性引起已有的限制性内切酶位点改变，则可先用相应的限制性内切酶切扩增产物，再进行琼脂糖凝胶电泳观察，根据产物片度大小和数量，与正常对照做出对比。
[0033]本发明通过上述实验，建立Pedigree基因分析数据库，应用拟合优度卡方检验和传递不平衡检验，应用UNPHASED分析软件进行单倍体传递卡方检验，利用GraphPadpr ism分析数据。
[0034]传递不平衡检验显示，SNP与青春型精神分裂症显著关联(P〈0.001).利用PCR-1^1^技术，检测到^1800497碱基为(1')与青春型精神分裂症临床症状总分相关(？〈0.05)。DAD2的rsl800497(T)与阳性症状、认知功能、阴性症状相关(P〈0.05)。
[0035]应用在线遗传统计SHEsis软件计算基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律;分析候选基因SNPs位点与精神分裂症的关联性;分析基因各个位点之间连锁不平衡程度及单倍型;应用MDR软件分析基因-基因间的交互作用;应用GraphPadpr i sm软件分析候选基因SNPs位点与精神分裂症临床症状。
[0036]本发明通过大样本的统计分析，研究了DRD2基因序列的rsl800497多态性位点在青春型精神分裂症患者的等位基因频率，并根据基因型在患病子女中的传递情况，进行传递不平衡检验和单体型分析，结果发现，全部样本的基因型分布和等位基因频率均符合Hardy-We inburg平衡，经过Bonferroni矫正，传递不平衡检验分析有显著的统计学差别，通过大样本实验进行了论证。
[0037]根据本发明由DRD2基因碱基突变特性判定青春型精神分裂症的易感人群的方法，可对未表现出临床症状的人群进行如下方法的筛查，rsl800497碱基为C的不易发生青春型精神分裂症。rsl800497碱基为T的个体为青春型精神分裂症易感人群，因此在日常生活中尽量要减少诱发因素，如环境中的刺激；同时青春型精神分裂症具有发病急，进程快等特点，在早期诊断后，要及时治疗，有此类病的家庭，千万不要讳疾忌医，致使病情日渐恶化、迀延，造成难以康复的结果。此病以药物治疗为主，辅之以心理治疗。对此病及早进行防治，是本发明的一个重要用途。
[0038]与现有技术相比，本发明的有益效果体现在:
[0039]1、本发明创造性对青春型精神分裂症易感性基因进行检测，精神分裂症根据不同临床表现、发病形式、临床特点、病程、治疗方案、治疗反应及预后等因素，可以分为单纯型、偏执型、青春型、紧张型、未分化型及残留型。目前的研究只泛泛针对精神分裂症的易感基因进行检测，但是不同类型的精神分裂症所涉及的易感基因是不同的，如果不对某种类型的疾病进行特异检测，必然特异性差，检测效果不好。
[0040]2、青春型精神分裂症在精神分裂症患者中，比例约占20%左右;常发病于青春期，急骤，病程发展较快，症状显著，内容荒谬，对青春型精神分裂症患者的早期检测尤为重要，早期检测，早期治疗可以有效抑制病程进展，治疗效果好。
[0041]3、本发明的试剂盒操作简单，属于本领域人员利用现有技术，能轻松实现的操作。