【具体实施方式】
[0042]实施例1
[0043]1、选择候选基因和SNPs
[0044]本发明人查阅文献、利用计算机互联网及生物信息学获取各方面精神分裂症候选基因研究，在11号染色体通过连锁不平衡分析方法进行单个核苷酸多态性(SNP)连锁不平衡分析，通过 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.go v/mapvi ewer)数据库，获得 DRD2 基因，并通过http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/SNP，http: //snp.cshl.0rg/数据库，搜索出符合其条件的候选基因SNPs。其入选标准:1、已有相关文献进彳丁报道;2、位点最小等位基因频率应大于10% ;3、所选SNPs必须能够符合引物设计软件的要求;4、所选位点不能影响基因分型实验
[0045]2、材料与方法
[0046]2.1研究对象
[0047]本发明以320例青春型精神分裂症和380例健康对照(身体健康，无躯体疾病，无家族遗传性疾病史，无精神疾病史，无药物滥用)为研究对象。所有研究对象均为中国汉族人，并且自愿签订伦理委员会批准的知情同意书。
[0048]2.2青春型精神分裂症的入组和排除标准
[0049]2.2.1入组标准
[0050](I)符合青春型精神分裂症诊断标准，PANSS评分I 60分；
[0051](2)年龄15-25岁，病程不超过24个月，未服用过任何抗精神病药物；
[0052](3)自愿参加并签署知情同意书。
[0053]2.2.2排除标准
[0054](I)诊断为非青春型精神分裂症患者；
[0055](2)明确中枢神经系统疾病，如中风、帕金森和癫痫等
[0056](3)严重躯体疾病，如感染、糖尿病和高血压等；
[0057]2.3诊断标准和量表评定
[0058]2.3.1诊断标准
[0059](I)国际疾病分裂标准第10版:精神分裂诊断标准(ICD-10);
[0060](2)《中国精神病分类与诊断标准》(第2版)修订本精神分裂症标准(CCMD-2-R);[0061 ] (3)所有病例均符合上述两个诊断标准，才能入组。
[0062] 2.3.2精神病状态量表评定
[0063 ]由2名经过培训的精神科医生同时对病人进行PANSS评分。
[0064]PANSS包括阳性症状分量表、阴性症状分量表和一般病理分量表。参与评定量表的2名医生均经过PANSS量表一致性培训。
[0065]2.3.3认知功能量
[0066]重复性成套神经心理状态测验(RBANS)是一个简明的、由单人操作的测验，目前是国际上常用的认知评定工具，包括12个分测验，可以概括成5组神经心理状态:即刻记忆(immediate memory)、注意(attent1n)、视觉广度(visuospatial/construct1nal)、语言(language)和延迟记忆(delayed memory)。由经过培训的检查者操作，完成整个检测一般需要时间20-30分钟，张保华等人已经将RBANS翻译成汉语版，并测试了精神分裂症患者和正常人组RBANS的信度和效度，结果表明该量表是一个信度、效度较好且简短易行的评定认知功能的量表。
[0067]3、血液和临床资料收集
[0068]受试者在认真阅读、理解、并自愿签署伦理委员会批准的项目知情同意书后，取外周静脉血5ml，-20度保存至提取基因组DNA。收集精神分裂症患者年龄、性别、家族史、民族和文化程度、首次入院和确诊时间、临床症状、认知功能等和疾病相关的资料;正常人收集一般人口学资料及认知功能评定量表。
[0069]3.1基因组DNA提取
[0070]采用专门提取DNA试剂盒，提取外周血的白细胞中全基因组的DNA。操作步骤如下:血液解冻、标记1.5mlEppendorf离心管—细胞裂解液900uL加入离心管中—加入解冻后全血200uL后，混勾，常温下作用20min，并颠倒4-6次410，000印111离心时间4111；[11，去除上清，然后振荡，使沉淀物再次悬浮—300uL核裂解液，然后轻轻地振荡，使其混匀，再37°C水浴30min—RNA降解酶1.5yL，振荡混匀，水浴15min，37°C—蛋白沉淀液10uL，轻弹管底，常温作用20min—12，000rpm离心4min，将上清液转移到已加入异丙醇300uL的离心管中，20min轻轻颠倒—12，OOOrpm离心4min，弃上清，加70 %乙醇300uL，轻轻摇勾—12，OOOrpm离心4min，弃上清，将离心管倾斜倒置，等待凉干—DNA溶解液10uL混匀，水浴Ih，65°C (或4°C过夜)，DNA在离心管中已制备完毕。
[0071]3.2基因组DNA质量检测
[0072]取1-2yL基因组DNA原液，通过琼脂糖电泳方法检测所提取DNA样品是否满足PCR-ALFP和Sequenom的质量标准要求;亮色字体表示该DNA样本符合基因分型技术要求;红色字体(无样本或样本量极少)表示该DNA不符合基因分型技术要求，需要予以重新提取。
[0073]3.3基因组DNA含量和纯度的检测
[0074]用NanoDrop-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计准确测定每份样本DNA含量和OD比值(4260/^230^260/^280)<^260/^230比值低:小分子杂质或残存的盐污染，若过高有未知的杂质。比值(A260/A280)低:蛋白或者苯酚有残留所致；比值(A260/A280)比值高:RNA有残留所致;通常A260/A280 ? 1.8代表样本DNA是纯净的
[0075]3.4设计引物
[0076]扩增DRD2基因rsl800497多态性的引物分别为:
[0077]ACGTTGGATGTGTGCAGCTCACTCCATCCT
[0078]ACGTTGGATGCAACACAGCCATCCTCAAAG
[0079]3.5PCR扩增目的片段
[0080]应用以上引物进行PCR扩增，PCR反应体系为20uL，其中含1mM Tris-HCl(PH8.4)，50mM KCl ,1.5mM MgC12，200uM (1见13，上下游引物各0.411]\^39聚合酶11]，0嫩模板30-50即，PCR扩增条件为:1、94°C5min，2、96°C45s，60°C60s，72°C60s 3个循环，3、95°C45s，59°C65s，72°C60s 5个循环，4、94°C45s，57°C60s，72°C60s，32个循环，5、72°C10min，取PCR产物5uL用
1.5%琼脂糖凝胶电泳，以DNAmarker为分子量标准品，扩增。
[0081]3.6限制性内切酶酶切鉴定基因型
[0082]酶切反应体系为20uL，其中1uLPCR产物，限制性内切酶TaqI 0.5uL，酶切缓冲液2uL，置37°C度温箱4小时，经3%琼脂糖凝胶电泳，根据酶切图谱判定基因型。
[0083]酶切结果:rsl800497(C)能被限制性内切酶TaqI切开，rsl800497(T)不能被切开，电泳结果显示rsl800497(C)比rsl800497(T)多一条电泳条带。
[0084]3.7结果判定
[0085]rsl800497碱基为(T)的个体为精神分裂症易感人群。
[0086]该位点共检测320例青春型精神分裂症患者，380例健康正常对照受试者；rsl800497位点为二态SNP;经酶切检测，在群体中出现不同的基因型结果。采用在线遗传统计SHEs i s软件分别分析患者、和健康对照受试者的基因型和等位基因频率，SNPs的基因型频率分布均符合H-W平衡，说明该研究的抽样群体符合H-W平衡。检测rs 1800497位点基因型和青春型精神分裂症患者认知功能的相关性，结果显示与阳性症状、阴性症状、认知有显著差异(P〈0.05)。说明该位点影响患者的临床症状。
[0087]实施例2
[0088]验证试验:采用本试剂盒，随机选取青春型精神分裂症患者样本20例，对照组样本20例，经PCR测序检测DRD2基因rsl800497位点多态性。
[0089]1、PCR 扩增:
[0090]PCR扩增条件为:1、94°C5min，2、96°C45s，60°C60s，72°C60s 3个循环，3、95°C45s，59°C65s，72°C60s 5个循环，4、94°C45s，57°C60s，72°C60s，32个循环，5、72°C1min，取PCR产物5uL用1.5 %琼脂糖凝胶电泳，以DNAmarker为分子量标准。
[0091]2、限制性内切酶酶切鉴定基因型
[0092]酶切反应体系为20uL，其中1uLPCR产物，限制性内切酶TaqI 0.5uL，酶切缓冲液2uL，置37°C度温箱4小时，经3%琼脂糖凝胶电泳，根据酶切图谱判定基因型。酶切结果:rsl800497(C)能被限制性内切酶TaqI切开，rsl800497(T)不能被切开。
[0093]3、结果
[0094]青春型精神分裂症患者中rsl800497碱基为(T)的个体为19例，健康对照组基因型全部为CC。本方法可以有效检测出青春型精神分裂症。
[0095]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
[0096]〈110〉青岛市肿瘤医院
[0097]〈120〉一种检测青春型精神分裂症易感性的试剂盒
[0098]<160>2
[0099]<210>1
[0100]<211>30
[0101]<212>DNA
[0102]〈213〉人工序列
[0103]<400>1
[0104]ACGTTGGATGTGTGCAGCTCACTCCATCCT
[0105]<210>2
[0106]<211>30
[0107]<212>DNA
[0108]〈213〉人工序列
[0109]<400>2
[0110]ACGTTGGATGCAACACAGCCATCCTCAAAG 。
【主权项】
1.一种检测青春型精神分裂症易感性的试剂盒，其包括:1)引物:扩增DRD2基因rsl800497多态性的引物分别为:ACGTTGGATGTGTGCAGCTCACTCCATCCTACGTTGGATGCAACACAGCCATCCTCAAAG2)PCR扩增缓冲液，Taq聚合酶，3)限制性内切酶TaqI和相应的缓冲液。
【专利摘要】本发明公开了一种检测青春型精神分裂症易感基因的试剂盒，本发明提供的检测青春性精神分裂症易感基因的方法为聚合酶链式反应-限制性长度多态性分析方法，通过此方法检测易感基因DRD2基因序列的一个多态性位点:rs1800497，利用本发明的试剂盒可以用来准确检测青春型精神分裂症易感基因，为青春型精神分裂症的深入研究和防治、诊断、治疗提供了新的思路。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105506164
【申请号】CN201610078938
【发明人】李莉, 张海茂, 赵自云
【申请人】青岛市肿瘤医院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年2月4日