长链非编码rna loc284454的应用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体设及检测卵巢癌组织中长链非编码RNA L0C284454表达量的试剂用于制备卵巢癌辅助诊断或者疗效预测制剂的用途。
【背景技术】
[0002] 人类基因组计划及其后续的DNA元件百科全书计划（The Encyclopedia of DNA Elements Project,ENCODE)研究成果表明，蛋白编码基因序列仅占人类基因组序列的1-3%，而人基因组中绝大部分可转录的序列为长链非编码RNA化ong non-coding RNA, IncRNAKLncRNA广泛地存在于各种生物中，且随着生物复杂程度的升高，基因组中IncRNA 序列的比例也相应地增大，提示IncRNA在生物进化过程中有重要意义。随着IncRNA不断被 发现，它们的功能逐渐被i全释，科学家们发现IncRNA广泛而活跃地参与到生命活动不同层 面的功能调控中，作为一个崭新的领域，已经成为国际生命科学研究领域新的前沿与热点。 [000 3] LncRNA可作为功能蛋白质的信号（signal)、诱导（guide)、诱巧（decoy)或支架 (scaffold)分子等多种方式，在染色质重构、基因转录、翻译及蛋白修饰等多重水平调控基 因的表达，并在包括发育、免疫、生殖等基本生理过程中扮演了不可替代的角色，更重要的 是，IncRNA的表达与功能失调已经与包括恶性肿瘤在内的人类多种疾病紧密联系在了一 起。因此，深入研究IncRNA的功能，掲示由IncRNA介导的遗传信息传递方式和表达调控网 络，不仅可W从蛋白编码基因 W外的角度重新注释和阐明基因组的结构与功能，深入发现 生命活动的本质和规律，还有望从一个新的视角认识包括肿瘤在内的多种人类常见疾病的 发病机理，并为运些疾病的诊断与治疗提供新的分子标志物与治疗祀点。
[0004]卵巢癌即卵巢恶性肿瘤，是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子 宫颈癌和子宫体癌而列居第Ξ位。但卵巢上皮癌死亡率却占各类妇科肿瘤的首位，对妇女 生命造成严重威胁。由于卵巢的胚胎发育、组织解剖及内分泌功能较复杂，早期症状不典 型，术前鉴别卵巢肿瘤的组织类型及良恶性相当困难。肿瘤的发生发展是多基因参与、多步 骤、多阶段的复杂过程，LncRNA在卵巢癌的发生发展过程中可能也起到了重要的作用。最近 我们在卵巢癌中发现IncRNA L0C284454(NCBI accession number:NR_036515)在卵巢癌中 表达显著上调，L0C284454表达高的患者更容易发生转移，其生存时间短于该IncRNA表达低 的患者，因此针对该IncRNA的检测制剂也可W用于卵巢癌的预后判断。
【发明内容】
[000引本发明的目的是提供检测卵巢癌组织中长链非编码RNA L0C284454表达量的试剂 用于制备卵巢癌辅助诊断或者疗效预测制剂的用途。
[0006] 检测卵巢癌组织中长链非编码RNA L0C284454表达量的试剂的应用，所述的试剂 用于制备卵巢癌辅助诊断或者疗效预测制剂；该长链非编码RNA L0C284454的序列如SEQ NO: 1所示。
[0007] 所述的卵巢癌辅助诊断或者疗效预测制剂为实时巧光定量检测试剂。
[0008] 所述的实时巧光定量检测试剂中包含用于实时巧光定量检测L0C284454表达的引 物序列：
[0009] 正向引物：5 ' -TGAAATCAGATGGGAGGAGGC-3 '，
[0010] 反向引物:5'-464〔4了64〔4〔4〔46〔4〔64-3'。
[0011] 所述的实时巧光定量检现聯剂中包含内参基因 GAPDH特异性PCR引物：
[0012] 正向引物5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 '
[0013] 反向引物5 ' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '。
[0014] 本发明从卵巢癌和卵巢癌旁样本中抽提RNA后逆转录，实时巧光定量法检测了 L0C284454的表达，结果显示L0C284454在卵巢癌组织中表达上调。提示L0C284454可作为卵 巢癌预后预测的分子标志。本发明为卵巢癌的辅助诊断和预后预测提供了强有力的分子生 物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
【附图说明】
[0015] 图1为L0C284454在卵巢癌组织中表达上调情况；
[0016] 实时巧光定量PCR技术检测IncRNA L0C284454在卵巢癌(28例)和卵巢癌旁(12例） 中的表达情况，P<〇. 001。
[0017] 图2为卵巢癌中L0C284454的表达与卵巢癌患者预后的关系；
[0018] 卵巢癌中L0C284454的高表达与卵巢癌患者的不良预后相关，旨化0C284454高表达 的患者总的生存时间（Over-all survival)要明显低于L0C284454低表达或不表达的患者， L0C284454表达高的患者更容易复发。
【具体实施方式】
[0019] W下结合【具体实施方式】进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0020] 实施例1，实时巧光定量PCR法检测证实L0C284454在卵巢癌中表达上调1.材料与 方法：
[0021 ] 收集12例卵巢癌旁和28例卵巢癌组织，抽提总RNA，lyg RNA经逆转录成cDNA后，进 行实时巧光定量PCRdL0C284454正向引物为5'-
[0022] TGAAATCAGATGGGAGGAGGC-3 '，如沈Q NO: 2所示，和反向引物5 ' -
[0023] AGACATGACACACAGCACGA-3 '。如沈Q NO: 3所示。
[0024] 用于对照的GAPDH正向引物为5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 '如沈Q NO: 4所示，和 反向引物5'-了〇：4〇：4〔〇：了6176(：了6了4-3'，如沈0備:5所示。
[0025] 实时巧光定量PCR反应体系 SYBR嚴 Premix Ex Taq'、1 (2x ) 1 ΟμΙ PCR Forward Primer (ΙΟμπι) 0.4μ1 PCR 民ev'erse Priiii汾' (Ι?'μLη.) 0.4υΙ
[0026] cDNA 模板 2.0μ1 dH：0 7.2μ1 Total 20μ!
[0027]实时巧光定量PCR反应步骤 [002引 1 94°C 5min
[0029] 2 95°C lOsec
[0030] 3 58°C 30sec
[0031] 4 72°C 20sec
[0032] 5 Plate read
[0033] 6 82°C 30sec
[0034] 7 Plate read
[00；35] 8 Go to step 2for more 39times
[0036] 9 Perform melting curve from 55.0°Cto 95.0°C，read eveiT 0.2°C，hold for Isec
[0037] 反应结束后确认实时巧光定量PCR的扩增曲线和烙解曲线，各基因的表达强度根 据CT值（t虹eshold cycle values)、内参基因（GAPDH)标化后，采用group t-test检验计算 P值。
[003引 2.结果
[0039] L0C284454在癌旁对照组织中不表达或者表达很低，而在卵巢癌组织中高表达P< 0.001(图 1)
[0040] 对28例卵巢癌患者进行了电话随访，详细询问了他们的首发时间、治疗情况、有无 复发、有无再患其他疾病、复发及死亡时间等，并登记了生存时间和状态，并对卵巢癌组织 中L0C284454的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析，发现L0C284454高表达患者 平均生存时间明显短于L0C284454低表达或不表达的患者（图2)。说明L0C284454是一个与 卵巢癌预后相关的分子标记，该IncRNA表达高，病人预后差。
【主权项】
1. 检测卵巢癌组织中长链非编码RNA L0C284454表达量的试剂的应用，其特征在于，所 述的试剂用于制备卵巢癌辅助诊断或者疗效预测制剂;该长链非编码RNA L0C284454的序 列如SEQ N0:1所示。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的卵巢癌辅助诊断或者疗效预测制剂 为实时荧光定量检测试剂。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的实时荧光定量检测试剂中包含用于 实时荧光定量检测L0C284454表达的引物序列： 正向引物:5 ' -TGAAATCAGATGGGAGGAGGC-3 '， 反向引物:5 ' -AGACATGACACACAGCACGA-3 '。4. 根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的实时荧光定量检测试剂中包含 内参基因 GAPDH特异性PCR引物： 正向引物5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ' 反向引物5 ' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '。
【专利摘要】本发明公开了检测卵巢癌组织中长链非编码RNA？LOC284454表达量的试剂的应用，主要是用于制备卵巢癌辅助诊断或者疗效预测的实时荧光定量检测试剂。通过研究证实LOC284454在卵巢癌组织中表达上调，高表达LOC284454的卵巢癌患者比低表达LOC284454的卵巢癌患者预后差，因此，将LOC284454的表达用于卵巢癌患者的预后预测，可以为卵巢癌患者的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105506158
【申请号】CN201610067499
【发明人】李桂源, 曾朝阳, 李小玲, 熊炜, 龚朝建, 张姗姗, 王裕民, 张雪莹, 李雨薇, 薛丹, 潘序雅, 邝彪
【申请人】中南大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月29日