一种用特异性pcr引物检测花椒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物的分子生物学检测技术，具体设及一种采用特异性引物PCR检测 花椒的方法。
【背景技术】
[0002] 花椒，为芸香科(Rutaceae)花椒属(Zanthoxylum)植物，是我国常用的溫里药，味 辛，性溫，归脾、胃、肾经，具有"溫中止痛，杀虫止痒"的功效。花椒不论作为药物还是食品都 有悠久的历史，在中国已有2000多年的种植和使用历史。在《中华人民共和国药典》（2015 版）中收载的花椒为芸香科植物青椒Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.或花椒 Zanthoxylum bungeanum Maxim.的干燥成熟果皮，用于治疗腕腹冷痛，呕吐泄泻，虫积腹 痛;外治湿疹，阴痒。花椒是一种具有较高的食用和药用价值的植物资源，含有多种对人体 有益的活性成分，其主要活性成分为挥发油、生物碱、脂肪酸、香豆素等，现代药理研究表 明，花椒具有调整胃肠运动、抗菌、杀虫、抑制血小板凝集、抗菌、抗肿瘤、抗氧化等作用，有 较好的临床应用价值和研发潜力。花椒种类繁多，全国有秦椒、川椒、岩椒等几十种品种，并 且全国各地有很多的习用品W及混伪品，严重影响了花椒的质量。
[0003] 花椒的常见混淆品有芸香科植物竹叶椒(Zanthexylum armatum DC.)、己氏吴荣 英巧vodia baberi Rehdet Wils.)、胡椒科植物胡椒(Piper nigrum Linn.)还有精科植物 山胡椒化indera glauca Bl)的成熟果实等。花椒、竹叶椒、己氏吴荣英、胡椒、山胡椒为五 种不同的香料植物，如混合或混淆入药，均将改变其传统的用药习惯，影响疗效，甚至出现 不良反应。有学者曾针对花椒进行过真伪鉴别，传统的鉴别方法包括:基源鉴定、性状鉴定、 显微鉴定等，现代的鉴别方法包括:红外光谱法、核磁共振氨谱法、电子鼻技术等，分子生物 学手段包括:rDNA ITS区序列比对分析、cpDNA付化斗间隔区序列比对分析等。核糖体基因 内部转录间隔区（ITS)序列存在于高度重复的核糖体中，进化速度快且长度不大，加上协同 进化使该片段在基因组不同单元间十分一致，因而适合进行各种分子操作。由于该区域受 外界环境因素的影响较小，进化速度快，因而具有种内变异小而种间变异大的特点，是种类 鉴定和系统发育分析的重要分子标记，可用于生物的分类、系统发育和遗传多样性的研究。
[0004] 本发明结合W上方法和技术的优点，依据分子标记技术的原理和原则，设计出6对 花椒特异性PCR鉴别引物，目的是提供一种特异性区分花椒的分子鉴别方法，并希望得到广 泛的实际应用推广。
【发明内容】
[000引本发明的目的是提供一种检测花椒的特异性PCR引物，W及用该特异性PCR引物快 速、准确地检测花椒的方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0007] 一种检测花椒的特异性PCR引物，其是如下6对引物中的任意一对：
[000引（1)上游引物F1:5'GCAATGCGAGCACTGCTT 3'
[0009] 下游引物R1:5'TCGTTCCCCGTGGGGGCGA 3'
[0010] (2)上游引物F2:5'GCAATGCGAGCACTGCTT 3'
[00川下游引物R2:5'CGGGTGCGGGACTAGTCT 3'
[0012] (3)上游引物F3:5'CACTGCTTGCGCAGAGCT 3'
[0013] 下游引物R3:5'TCGTTCCCCGTGGGGGCGA 3'
[0014] (4)上游引物F4:5'CACTGCTTGCGCAGAGCT 3'
[0015] 下游引物R4:5'CGGGTGCGGGACTAGTCT 3'
[0016] (5)上游引物F5:5'TATGAGTCCCGAAACAGGGG 3'
[0017] 下游引物R5:5'TCGTTCCCCGTGGGGGCGA 3'
[001 引（6)上游引物F6:5'TATGAGTCCCGAAACAGGGG 3'
[0019] 下游引物R6:5'CGGGTGCGGGACTAGTCT 3'
[0020] -种用特异性PCR引物检测花椒的方法，包括W下步骤：
[0021] 1)提取样品中的DNA;
[0022] 2) W步骤1)中提取的DNA为模板，使用上述引物中的任意一对进行PCR扩增反应；
[0023] 3)分析PCR产物，即对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果 判定样品是否为花椒。
[0024] 其中，PCR扩增反应体系Κ25μ1计为： 模板DNA 3 μ1 10 μΜ上游引物 1 μ1
[0025] 10 μΜ 下游引物 1 μ1 l^EasyTaq PCR SupcrMix 12 5 μΙ 舶恥Ο IS μL
[00%] PCR 反应条件为：93°C5min; 93°C30s，69°C30s; 72°C30s，共 30 个循环；72°C5min，10 °C10min。
[0027] PCR扩增反应结束后，若电泳检测结果出现约52化p左右的单一 DNA条带，则该样品 中含有花椒。
[002引本发明基于花椒的ITS序列，设计出可快速检测花椒的特异性引物，并在此基础上 建立PCR检测体系，为花椒的鉴别提供了分子鉴定依据。根据该特异性引物建立的检测方 法，操作简便，特异性好，灵敏度高，可实现对花椒的检测，适于广泛的推广使用。
【附图说明】
[0029] 图1是利用6对花椒特异性引物分别对嘉华花椒和青椒PCR扩增后产物的琼脂糖凝 胶电泳图，其中 1-1、2-1、3-1、4-1、5-1、6-1的0魁模板为嘉华花椒，1-2、2-2、3-2、4-2、5-2、 6-2的DNA模板为青椒，产物条带分别为51加 p、532bp、50加9、52269、47869、48化9;1为化 2000DNA Marker。
[0030] 图2是利用第6对花椒特异性引物扩增不同浓度的嘉华花椒的琼脂糖凝胶电泳图， 其中 1-6 号 DNA 浓度分别为 4.143ng/yl、2.0715ng/yl、1.381ng/yl、1.03575ng/yl、 ο . 8286ng/yl、0.4143ng/yl时的嘉华花椒PCR产物条带，产物485bp ;M为DL 2000DNA Markerο
[0031] 图3是利用6对花椒特异性引物分别对同仁堂花椒和万民花椒PCR扩增后产物的琼 脂糖凝胶电泳图，其中1-3、2-3、3-3、4-3、5-3、6-3的0魁模板为同仁堂花椒，1-4、2-4、3-4、 4-4、5-4、6-4的DNA模板为万民花椒；1-3、1-4的引物为第1对引物对，2-3、2-4的引物为第2 对引物对，3-3、3-4的引物为第3对引物对，4-3、4-4的引物为第4对引物对，5-3、5-4的引物 为第5对引物对，6-3、6-4的引物为第6对引物对;产物的条带分别为51化p、532bp、50加 P、 522bp、478bp、485bp;M为DL 2000DNA Marker。
【具体实施方式】
[0032] W下实施例用于说明本方法，但不用来限制本发明的范围。
[0033] 若未特别指明，W下实施例均按照常规实验条件，如S