原位杂交检测舌癌组织中长链非编码rna loc284454试剂的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体设及原位杂交检测舌癌组织中长链非编码 RNA L0C284454试剂用于制备舌癌辅助诊断或者疗效预测制剂的用途。
【背景技术】
[0002] 人类基因组计划及其后续的DNA元件百科全书计划（The Encyclopedia of DNA Elements Project,ENCODE)研究成果表明，蛋白编码基因序列仅占人类基因组序列的1-3%，而人基因组中绝大部分可转录的序列为长链非编码RNA化ong non-coding RNA, IncRNAKLncRNA广泛地存在于各种生物中，且随着生物复杂程度的升高，基因组中IncRNA 序列的比例也相应地增大，提示IncRNA在生物进化过程中有重要意义。随着IncRNA不断被 发现，它们的功能逐渐被i全释，科学家们发现IncRNA广泛而活跃地参与到生命活动不同层 面的功能调控中，作为一个崭新的领域，已经成为国际生命科学研究领域新的前沿与热点。 [000 3] LncRNA可作为功能蛋白质的信号（signal)、诱导（guide)、诱巧（decoy)或支架 (scaffold)分子等多种方式，在染色质重构、基因转录、翻译及蛋白修饰等多重水平调控基 因的表达，并在包括发育、免疫、生殖等基本生理过程中扮演了不可替代的角色，更重要的 是，IncRNA的表达与功能失调已经与包括恶性肿瘤在内的人类多种疾病紧密联系在了一 起。因此，深入研究IncRNA的功能，掲示由IncRNA介导的遗传信息传递方式和表达调控网 络，不仅可W从蛋白编码基因 W外的角度重新注释和阐明基因组的结构与功能，深入发现 生命活动的本质和规律，还有望从一个新的视角认识包括肿瘤在内的多种人类常见疾病的 发病机理，并为运些疾病的诊断与治疗提供新的分子标志物与治疗祀点。
[0004]舌癌是最常见的口腔癌，男性多于女性。舌癌多数为鱗癌，多发生于舌缘，其次为 舌尖、舌背及舌根等处，常为溃瘍型或浸润型。一般恶性程度较高，生长快，浸润性较强，常 波及舌肌，致使舌运动受限，使说话、进食及吞咽均发生困难。肿瘤的发生发展是多基因参 与、多步骤、多阶段的复杂过程，LncRNA在舌癌的发生发展过程中可能也起到了重要的作 用。最近我们在舌癌中发现IncRNA L0C284454(NCBI accession number:NR_036515)在舌 癌中表达显著上调，L0C284454表达高的患者更容易发生转移，其生存时间短于该IncRNA表 达低的患者，因此针对该IncRNA的检测制剂也可W用于舌癌的预后判断。
【发明内容】
[000引针对上述现有技术，本发明的目的是提供原位杂交检测舌癌组织中长链非编码 RNA L0C284454试剂用于制备舌癌辅助诊断或者疗效预测制剂的用途。
[0006] 原位杂交检测舌癌组织中长链非编码RNA L0C284454试剂的应用，所述的试剂用 于制备舌癌辅助诊断或者疗效预测制剂;该长链非编码RNA L0C284454的序列如SEQ NO: 1 所示。
[0007] 所述的原位杂交检测舌癌组织中长链非编码RNA L0C284454试剂包括W下用于原 位杂交检测L0C284454表达的寡核巧酸探针中的一种或几种：
[000引 L0C284454探针1:5 ' -CCAACATGGCGAAACTCGGTCTCTACTAAAAATAC-3 ' ；
[0009] L0C284454探针2:5 ' -ACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAGATTAGCCGG-3 ' ；
[0010] L0C284454探针3:5 ' -TTATTTACTTGAACAACAGACATGACACACAGCAC-3 '。
[0011] 所述的原位杂交检测舌癌组织中长链非编码RNA L0C284454试剂包括W下阳性对 照探针中的一种或几种：
[0012] GAPDH 探针1:5 ' -CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3,
[0013] GAPDH 探针2:5 ' -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3,
[0014] GAPDH探针3:5 ' -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3 '。
[0015] 本发明通过原位杂交在舌癌和舌癌癌旁上皮存档石蜡组织标本中发现L0C284454 在舌癌中表达显著上调，且L0C284454的表达与预后密切相关，L0C284454表达高的患者生 存时间更短，提示L0C284454可作为舌癌预后预测的分子标志。本发明为舌癌的辅助诊断和 预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
【附图说明】
[0016] 图1为实时巧光定量PCR技术检测IncRNA L0C284454在舌癌患者（167例)和舌癌癌 芳组织(45例）中的表达情况;L0C284454在舌癌中的表达比癌芳组织中显著提局，p<0.001。
[0017] 图2为原位杂交检测L0C284454在舌癌及舌癌癌旁上皮中的表达情况；
[001引舌癌癌旁组织中表达水平较低(30.2%，13/43)，而在52.7%的舌癌（148例舌癌组 织中的78例）中检测到有L0C284454的表达，P<0.001。
[0019] 图3为舌癌中L0C284454的表达与舌患者预后的关系，
[0020] 舌癌中L0C284454的高表达与舌癌患者的不良预后相关，目化0C284454高表达的患 者总的生存时间（Over-all survival)要明显低于L0C284454低表达或不表达的患者。
【具体实施方式】
[0021] W下结合【具体实施方式】进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0022] 实施例1，实时巧光定量PCR法检测证实L0C284454在舌癌中表达上调 [00 2引1.材料与方法：
[0024] 收集45例舌癌癌旁和167例舌癌组织，抽提总RNA，lyg RNA经逆转录成cDNA后，进 行实时巧光定量？〔3。10〔284454正向引物为5'-46〇：4了〇：1^〇：4〇：刊461'-3'，如沈0^:2所 示，和反向引物5'-了〇：1^461^〇：4〔〇：46444-3'。如沈0備:3所示。
[002引用于对照的GAPDH正向引物为5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 '如沈Q NO: 4所示，和 反向引物5'-了0：40：4〔0：了6176(：了6了4-3'，如沈0備:5所示。
[0026]实时巧光定量PCR反应体系 SYBR貧 Prcmix Ex Taq 1、1 (2x ) 1 ΟμL PC艮 Forward Primer ( 10μηι> 0.4μ1 PCR Reverse Primer (ΙΟμιη') 化4μ1
[0027] cDNA 巧板 2.0μ1 dH'2〇 7.2μΙ Total 20μ1
[0028] 实时巧光定量PCR反应步骤 1 94V 5 min 2 95 C 10 see 3 斑。C 30 see 4 11'Q 20 see
[0029] 5 Plate read 6 82 °C 30 sec 7 FMtac read 8 Go to step 2 for more 39 times 9 Perform mclling curve from 55.0'C to 95.0'C, read every 0.2 C , hold lor 1 see
[0030] 反应结束后确认实时巧光定量PCR的扩增曲线和烙解曲线，各基因的表达强度根 据CT值（t虹eshold cycle values)、内参基因（GAPDH)标化后，采用group t-test检验计算 P值。
[0031 ] 2.结果
[0032] L0C284454在舌癌癌旁对照组织中不表达或者表达很低，而在舌癌组织中高表达P <0.00!(图1)
[0033] 实施例2,原位杂交检测发现L0C284454在舌癌中的表达与患者预后相关
[0034] 1.材料方法
[0035] 1.1设计并合成杂交探针
[0036] 为了采用原位杂交方法检测L0C284454的表达情况，我们设计了针对原位杂交检 测L0C284454表达的寡核巧酸探针及阳性对照两组原位杂交寡核巧酸探针各3条。
[0037] 用于原位杂交检测L0C284454表达的寡核巧酸探针：
[0038] L0C284454探针1:5 ' -CCAACATGGCGAAACTCGGTCTCTACTAAAAATAC-3 ' 如沈Q NO: 6所 示，
[0039] L0C284454探针2:5 ' -ACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAGATTAGCCGG-3 ' 如沈Q NO: 7所 示，
[0040] L0C284454探针3:5 ' -TTATTTACTTGAACAACAGACATGACACACAGCAC-3 ' 如沈Q NO: 8所 /J、- 〇
[0041 ]阳性对照探针(检测看家基因 GAPDH):
[0042] GAPDH探针1:5 ' -CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3 '，如沈Q NO: 9所示，
[004引 GAPDH探针2:5 ' -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3 '，如沈Q NO: 10所示，
[0044] GAPDH探针3:5 ' -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3 '，如沈Q NO: 11所示。
[0045] 采用化学合成方法合成上述设计的各基因特异性寡核巧酸探针序列。
[0046] 1.2寡核巧酸探针标记试剂盒和原位杂交检测试剂
[0047] 地高辛寡核巧酸加尾试剂化ig Oligonucleitide Tailing Kit 2nd Generation, Roche公司），抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂盒(Anti-Digoxigenin-PODJab fragments, Roche公司），增强原位表达检测信号的TSA信号放大系统（TSA? Biotin System,肥L700试剂盒，Perki址Imer公司），DAB染色试剂盒（北京中山公司），20x巧樣酸钢 缓冲溶液（saline sodium citrate,SSC)，硫酸葡聚糖(；Dextran sulphate),去离子甲酯胺 (Deionized Formamide)，多聚腺巧酸（polyadenylic acid,Poly A)，多聚脱氧腺巧酸 (polydeoxyadenylic acid,Poly dA)，变性剪切的蛙精DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)，酵母转运RNA(yeast t-RNA，tRNA)，二硫苏糖醇化TT)，50x邓罕 氏缓冲液(Denhardts's solution)，憐酸缓冲液(PBS buffer)，胃蛋白酶Κ，牛血清白蛋白 (BSA)，Ξ乙醇胺（TEA)，TNBBuffer(0.1MTris-HCl，抑7.5,0.15M化CL，0.5%Blocking Reagent)，TNTBuffer(0.1MTris-肥l，抑7.5,0.15M化化，0.05%Tween20)，醋酸酢，阻 断子式齐iKBlockin邑rea邑ent a邑ent，Roche公司）。
[004引1.3其他主要试剂和材料
[0049] 无水乙醇、90 %酒精、70 %酒精、50 %酒精、松节油、双蒸水、PBS缓冲液(pH7.2~ 7.4，化(：1137111111〇1/1，1((：12.7臟〇1/1，化抽口〇4 4.3111111〇1/1，1(此口〇4 1.4111111〇1/1);3%甲醇-双氧水溶液(80%甲醇和30%双氧水