配置）；0.01mol/L巧樣酸盐缓冲液（citrate buffer, CB，p册.0±0.1，9ml 0.1 M巧樣酸溶液和41ml 0.1 M巧樣酸钢溶液加入450ml蒸馈水中临时 配置后再校正工作液抑值）；0.1 %膜蛋白酶;苏木素；1 %盐酸酒精（1ml浓盐酸+99ml 70 % 酒精配置）；封片胶(PTS Cure Mountn );专用盖玻片(480X240mm2)定制于郑州玻璃仪器 厂。Leica低烙点（58°C)石蜡，国产蜂蜡，无水酒精，二甲苯，10%中性多聚甲醒(O.Olmol/L， 抑7.4，DEPC双蒸水和PBS缓冲液配制），苏木素，伊红，中性封片树胶，盖玻片，载玻片。1.4标 记探针
[0050] 利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit进行寡核巧酸探针标记，反应体系如 下。
[0051] l'00pm:ol oUgon'ucle'oti过e' + :过过扫2〇; =9 'μ1'((：οιι?χοΙ: con化oi oligQ打'uoleutide 5μ1 + 过difeO'斗μL) Reaction buHcr 4μΙ Cod： 4μ1 Dig-dllTP 1μ1 ?ΚΤν 1μ1 Terminal Iranslerasc 叫
[00划混匀，稍离屯、。37°C水浴反应30min，加 2μ1邸TA(0.2M，PH 8.0)中止反应。
[0053] 1.5寡核巧酸探针标记后纯化
[0054] 为了增加标记探针的纯度，需对已标记的探针进行纯化，具体操作如下：
[00巧]1)探针反应混合物（2化1)+2.5414]?11化巧如1100%冷乙醇（-20。〇.
[0056 ] 2) -70°C 沉淀 60min，or-20°C 化。
[0057] 3)13.000Xg 4°C离屯、15min。
[005引 4)弃上清，用50μ1冰冷的70% (V/V)乙醇洗涂。
[0059] 5)13.000xg 4°C，离屯、5min。
[0060] 6)弃上清，真空4°C干燥。
[0061 ] 7)用无菌双蒸水重溶探针。
[0062] 1.6原位杂交检测存档石蜡切片中L0C284454的表达
[0063] 石蜡切片杂交前处理
[0064] 1)4°C保存的石蜡切片置于58°C烤片30min，烙化表面石蜡。
[006引 2)二甲苯依次脱蜡3X5min。
[0066] 3)梯级酒精洗涂，100% 酒精 2X2min 一 95% 酒精 lX5min 一 70% 酒精 lX5min 一 50%酒精lX5min一DEPC水洗涂2X3min一DEPC-PBS洗涂2X5min。
[0067] 4)滴加300μ1胃蛋白酶K(10μg/ml)于切片上，37°C消化20min。
[006引 5)切片入PBS(0.1M PBS+2mg/ml谷氨酸)洗涂Imin，中止反应。
[0069] 6)切片入0.2N肥L，于37°C反应20-30min，增加组织的通透性。
[0070] 7)切片用4%多聚甲醒(0.1M PBS溶解)后固定lOmin，室溫。
[0071] 8)为了增加组织阳性杂交强度，对切片进行乙酷处理。切片入0.25%乙酸酢 Buffer 1(0.1ΜΞ 乙醇胺），室溫 lOmin。
[007引 9)11 PBS 洗涂 2X5min。
[0073] 预杂交和杂交
[0074] 预杂交:-20°C保存的预杂交液，先置于37°C解育60min，预杂交液的用量为50μ1， 石蜡膜履盖切片，37°C湿盒中预杂交2小时。（预杂交液成份包括：2XSSC，10%Dextran sul曲ate,IX Denhar化'S solution，50mM Phosphate Buffe;r(PH 7.0)，50mM 0ΤΤ，250μ1， lOOμg/ml poly A,扣g/ml poly dA，250μg/ml yeast t-RNA，500μg/ml ssDNA，47% Deionized formamide)。
[0075] 1)移去石蜡膜，甩掉预杂交液，切片置于2 X SSC中5min。
[0076] 2)杂交反应：37°C杂交过夜（18-20h)。每一切片加入25化1杂交液并用石蜡膜履 盖。预杂交液中加入相应的探针就成为杂交液。杂交液在预杂交时配制，放置37°C解育，使 探针充分溶解于杂交液中，本实验用多条寡核巧酸探针混合，按每一探针500ng/ml浓度配 制成探针杂交液。地高辛加尾标记试剂盒标记探针浓度计算依据:每一探针的浓度按其与 阳性定量探针时检测反应时显色进行比对和10化mol 30个碱基的裸探针标记反应理论探 针产量为90化g两种标准进行综合计算出标记探针的浓度。
[OOW] 3)杂交后洗涂，切片浸入2 X SSC，lOmin，掲去石蜡膜。依次于摇床上摇动洗涂，2 X SSC(0.5%SDS)，2X15min^0.25XSSC(0.5%SDS)，2X15min。
[0078] 杂交后显色检测反应
[0079] 1)采用Anti-Digoxigenin-POD检测地高辛探针与mRNA结合复合物；TSA放大系统 增强原位杂交反应显色反应的阳性信号，DAB显色。
[0080] 2)切片转至TNT缓冲液中，3X5min。
[0081 ] 3)滴加 TNB 阻断缓冲液，300yl/TMAs，室溫，30min。
[0082] 4)吸去多余阻断剂，l:100稀释的Anti-Digoxigenin-P0D(TBS+0.1%TritonX-100+1 %阻断剂），室溫4小时。
[0083] 5)TNT BuffeHO.lM Tris-CL，pH7.5,0.151 NaCL，0.05%Tween 20)洗涂， 3x5min。
[0084] 6)切片上滴加信号放大试剂Biotinyl Tyamid，300yl/TMAs，（Biotinyl Tyramid 胆存液:Biotinyl Tyramid溶解于0.2ml DMS0，Biotinyl Tyramid工作液：1X稀释液，1:50 稀释Biotinyl Tyramid胆存液），室溫10分钟。
[0085] 7)TNT洗，3X5min。
[0086] 8)切片滴加 SA-HRP(链霉卵白素-辣根过氧化物酶），3(K)yl/TMAs，室溫30min。
[0087] 9)TNT洗，3X5min。
[008引10)蒸溜水洗涂，IXlmin。
[0089] 11)DAB显色，显微镜下控制显色反应。
[0090] 12)苏木素复染，
[0091] 13)酒精梯级脱水，切片干燥。
[0092] 14)滴加封片胶，相应规格的盖玻片盖片，紫外灯下交联切片Imin。
[0093] 1.7结果判断及标准
[0094] 应用光学显微镜分别在低倍和高倍镜下进行观察，首先观察目标RNA的阳性表达 信号在观察目标细胞内的定位:位于细胞核、细胞浆或细胞膜。
[0095] 再分别W该检测RNA表达部位阳性信号的强度和阳性表达的细胞数两种标准进行 综合评分，判断标准为：（1)依据阳性细胞染色强度判断:a.细胞无染色，记0分;b.细胞染成 浅栋色为弱阳性，记1分;C.细胞染成栋色且无背景着色，或细胞染成深栋色并有浅栋色背 景为中等阳性，记2分;d.细胞染成深栋色且无背景着色为强阳性，记3分。（2)依据阳性细胞 表达数计分:a.无阳性细胞表达，记0分;b.阳性表达细胞数含25%，记1分;C. 25% <阳性细 胞数<50%，记2分;d.阳性表达细胞数含50%，记3分。
[0096] 为了尽量降低评分结果的主观因素，由两位病理学专家分别按上述标准之一各自 进行判断和评分，再将两者评分相乘，结果为:①0分者最终计为0分，认为阴性表达;②1分 和2分者最终计为1分，认为弱阳性表达;③3分和4分者最终计为2分，认为中等阳性表达;④ 6分到9分者最终计为3分，认为强阳性表达。
[0097] 1.8分析和统计软件
[0098] 应用SPSS13.0统计软件对实验结果进行统计学分析，两两比较用^test或Fisher exact test，相关性分析采用Spearmen correlation方法;P<0.05即差异有统计学意义。 生存曲线分析采用Kaplan-Meier method及log-rank test;多变量分析采用Cox's proportional hazards model ;P<0.05即差异有统计学意义。
[0099] 2 结果
[0100] 2.1 L0C284454在舌癌中的表达比舌癌癌旁组织中的表达显著升高
[0101] L0C284454在52.7%的舌癌组织(78/148例）中高表达，而仅在30.2%的舌癌癌旁 组织中（43例中的13例)有表达(图2)，两者之间具有明显的统计学差异(P<0.001)。
[0102] 2.2 L0C284454高表达的舌癌患者预后较差
[0103] 对148例舌癌患者进行了电话随访，详细询问了他们的首发时间、治疗情况、有无 复发、有无再患其他疾病、复发及死亡时间等，并登记了生存时间和状态，并对舌癌组织中 L0C284454的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析，发现L0C284454高表达患者平 均生存时间明显短于L0C284454低表达或不表达的患者（图3)。说明L0C284454是一个与舌 癌预后相关的分子标记，该IncRNA表达高，病人预后差。
【主权项】
1. 原位杂交检测舌癌组织中长链非编码RNA L0C284454试剂的应用，其特征在于，所述 的试剂用于制备舌癌辅助诊断或者疗效预测制剂;该长链非编码RNA L0C284454的序列如 SEQ N0:1 所示。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的原位杂交检测舌癌组织中长链非编 码RNA L0C284454试剂包括以下用于原位杂交检测L0C284454表达的寡核苷酸探针中的一 种或几种： L0C284454探针1:5 ' -CCAACATGGCGAAACTCGGTCTCTACTAAAAATAC-3 ' ； L0C284454探针2:5 ' -ACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAGATTAGCCGG-3 ' ； L0C284454探针3:5 ' -TTATTTACTTGAACAACAGACATGACACACAGCAC-3 '。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的原位杂交检测舌癌组织中长链 非编码RNA L0C284454试剂包括以下阳性对照探针中的一种或几种： GAPDH 探针1:5 '-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3 ' GAPDH 探针2:5 ' -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3， GAPDH探针3:5 ' -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3 '。
【专利摘要】本发明公开了原位杂交检测舌癌组织中长链非编码RNA？LOC284454试剂的应用，主要用于制备舌癌辅助诊断或者疗效预测制剂。通过研究证实LOC284454在舌癌组织中表达上调，高表达LOC284454的舌癌患者比低表达LOC284454的舌癌患者预后差，因此，将LOC284454的表达用于舌癌患者的预后预测，可以为舌癌患者的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105506157
【申请号】CN201610066689
【发明人】熊炜, 曾朝阳, 李小玲, 李桂源, 喻建军, 刘彦, 唐艳艳, 杨丽婷, 石磊, 范松青, 张文玲, 向波
【申请人】中南大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月29日