一种高效检测水稻抗性基因Pita的特异性引物、分子标记及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种高效检测水稻抗性基因 Pita关键抗病位点的特异性引物、分子标 记及其检测方法，属于水稻遗传改良与农业生物技术应用领域。 技术背景
[0002] 稻攝病是造成水稻严重减产的主要病害之一，每年因稻攝病导致的生产损失约占 总产量的10~15%。目前，发掘广谱稻攝病抗性基因，通过育种培育广谱持久抗病的水稻品 种是控制稻攝病的主要措施。因此，稻攝病抗性基因的检测W及稻攝病抗性水稻种质筛选 就显得尤为重要。
[0003] 抗病基因相关的分子标记在遗传育种方面具有重要的意义，分子标记辅助育种 (marker-assisted selection,MAS)对于幼苗的筛选和基因型的确定具有简单、快捷、经济 节约的优点，适合在大样本中筛选、分析具抗性基因的个体和品种。
[0004] 水稻对稻攝病的抗性符合基因对基因学说。目前在基因对基因学说中水稻的抗性 基因 Pi化和稻攝菌的无毒基因 AVR-Pita是研究得最为详尽的一对互作关系。AVR-Pita编码 223个氨基酸的金属蛋白酶，能与抗性基因 Pi化产物直接作用。Pita是第一个被克隆的抗性 基因。Pita基因编码一个长度为928氨基酸的细胞质膜受体蛋白，该蛋白含核巧酸结合位点 结构域(NBS)和富亮氨酸结构域(LRD)。
[000引Pi化基因抗病/感病两种基因型的编码产物仅有一个氨基酸的差异，即第918氨基 酸由抗病型的丙氨酸突变为感病型的丝氨酸，抗病型的Pita基因编码产物的LRD(包含918 氨基酸位点）能与稻攝病菌无毒基因 AVR-Pita编码产物相互作用，引起水稻防卫响应和细 胞程序性死亡，从而免受稻攝病菌侵染。而感病型的Pita基因编码产物则不能与AVR-Pita 编码产物相互作用，导致感病(B巧an et al.，2000;Jia et al.，2000)。
[0006] Pita 918氨基酸的改变是由于Pita基因 DM序列的6640位点（GenBank No. AF207842)的突变引起的，当该位点核巧酸为G时，所在密码子编码丙氨酸，抗病；当该位 点为T时，所在密码子编码丝氨酸，感病(Jia et曰1.，2003)。运种由DNA碱基的一个差异所 造成抗/感病差异，为使用PCR引物进行带有抗病位点的品种的筛选提供了有利条件，是分 子标记辅助育种的经典应用。
[0007] Jia等人曾根据Pita基因 DNA位点的变异W及6640位点与6276位点的连锁，设计了 检测6640位点核巧酸变异的特异性引物(YL100/YL102)(Jia et al. ,2002)。但是发明人也 发现原设计特异性引物识别具有假阳性的现象，也就是说有时候不管6640位点是G还是T， 该引物都能扩增出相应的DNA片段，运就导致该分子标记不具有严格的特异性，要进一步确 认6640位点的状况还需要通过DNA测序的方式进行确认，显得耗时、耗力、昂贵;此外，Jia等 人的引物所基于的两个变异位点（6640和6272)在世界范围内其它地区水稻样本中连锁率 很低，导致他们的引物不可用于其它地区水稻的Pi化抗性基因型检测。
[0008] 因此，为了更加准确和更加广泛地利用特异性引物检测Pita基因关键抗病位点 6640的变异，本发明拟通过大规模实验筛选和数据分析，对识别该位点的特异性PCR引物、 实验反应体系和实验反应条件进行设计、实验和优选，提供一种快速、准确、特异性强的检 测Pi化基因抗病基因型的专用引物。
[0009] 参考文献；
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【发明内容】
[001引针对上述技术问题，本发明意在克服现有检现版术中出现假阳性、耗时、昂贵从及 不具有广泛适用性等缺陷。其目的是提供一种快速、准确、特异性强的检测Pita基因抗病基 因型的特异性专用引物、分子标记和检测方法。
[0016] 为解决上述技术问题和实现本发明目的，本发明采用的技术方案如下：
[0017] -种高效检测水稻抗性基因 Pi化关键抗病位点的特异性引物，所述引物由前引物 (6640巧和后引物(7415R)组成，所述的引物序列：
[0018] 前引物6640F: 5 ' -GTGGCTTCTATCTTTACCTG-3 '
[0019] 后引物7415R: 5 ' -CGAACTCCTTCGCATACTCA-3 '
[0020] -种高效检测水稻抗性基因 Pi化抗病基因型的分子标记，所述的分子标记为根据 权利要求1所述的特异性引物在Pita基因序列及其3'端调控区扩增出来的核巧酸序列，核 巧酸序列长度为814bp。
[0021] -种利用分子标记检测水稻抗性基因 Pi化抗病基因型的方法，包括W下步骤：
[0022] (1)待测样品水稻植株基因组DNA提取；
[0023] (2) W步骤(1)中得到的样品DNA为模板，构建专用PCR反应体系，利用权利要求1所 述特异性引物进行PCR扩增；
[0024] (3)利用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，当PCR产物为阳性时，也即能获 得条带长度为814bp的PCR产物，该水稻品种对稻攝病菌(含AVR-Pita)具有抗性;反之，当 PCR产物为阴性时，即不能获得条带长度为814bp的PCR产物，该水稻品种对稻攝病菌（含 AVR-Pita)具有感病性。
[002引优选地，所述的专用PCR反应体系为：10XPCR反应缓冲液2.祉l;2.5mM dNTP Ι.ομ 1; BSA 1.0μ1;前引物0.祉1;后引物0.祉1; r-taq酶0.2扣1;~20ngAU DM为1.0μ1;加水至 总体积为25μ1。
[0026] 优选地，所述的专用PCR反应条件为:94°C预变性3min，94°C变性30sec，53°C~60 °C退火30sec，72°C延伸Imin，共运行33个循环，72°C后延伸lOmin
[0027] 本发明的原理：
[0028] 基于不同突变位点的连锁情况，选择适合特异性引物设计的位点（6640和7415)。 根据引物3'末端需高度匹配的特点，设计区分6640位点抗/感病的特异性引物，利用该引物 PCR扩增产物作为分子标记检测水稻Pita基因6640位点抗/感病分布情况。即W水稻样本 DNA为模版进行PCR扩增，若获得条带长度为814bp的PCR产物，则说明该水稻品种对于稻攝 病菌(含AVR-Pita)具有抗性;若未获得相应的PCR产物带，则说明该水稻品种感病。
[0029] 本发明的有益效果：
[0030] 1.本发明具有简单、快捷、经济节约的优点，适合在大样本中筛选、分析具抗性基 因型的个体和品种。
[0031] 2.本发明特异性专用引物的特异性强，检测结果更为准确，正确率可达100%。
[0032] 3.本发明利用基于特异性引物的分子标记检测水稻抗性基因 Pita的关键抗病位 点时，只需要进行一次PCR扩增，可提高Pita基因的检测效率，适合用于水稻改良分离群体 的分子标记辅助育种，提高育种效率，满足大规模分子育种的需求。
【附图说明】
[0033] 图1为鉴定抗病位点的特异性引物应用设计流程图；
[0034] 图2为Pi化基因关键抗病位点区域DNA序列比对图；
[0035] 图3为特异性引物退火溫度筛选电泳图；其中第1和18泳道为DNA Marker 2000,第 2,3,6,7，10，11，14，15泳道为？11日抗性位点66406，第4,5,8,9，12，13，16，17泳道为？1化感 病位点6640T，其中图（A)本发明利用Pita基因6640与7415位点连锁设计特异性引物，退火 溫度依次为第2-5泳道60°C，第6-9泳道58°C，第10-13泳道55°C，第14-17泳道53°C;图（B)为 已有发明引物的退火梯度，退火溫度依次为第2-5泳道64.5°C，第6-9泳道60°C，第10-13泳 道58°(3，第14-17泳道55°(3;
[0036] 图4为水稻总DNA凝胶电泳检测图；其中第1泳道为空白对照，第2-11泳道为水稻幼 苗DNA提取检测图，第12泳道为DNA Marker(Trans2K Plus DNA Marker),从上到下的条带 依次为 5000、3000、2000、1000、750、500、250、1 OObp;
[0037] 图5为扩增水稻Pita抗病基因型电泳检测图，目的是大样本量验证特异性引物的 可靠性，其中第巧日22泳道为DNA Marker 2000,第2-11泳道为含Pi化感病位点6640T的水稻 样本，第12-21泳道为含Pi化抗性位点