其5'端标记英光报告基团，3'端标记非英光浑 灭基团。当探针完整时，报告基团所发射的英光能量被浑灭基团吸收，仪器检测不到信号。 随着PCR的进行，Taq酶在核酸链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3' - 5'外切核酸 酶活性就会将探针切断，报告基团原理浑灭基团，其能量不能被吸收，即产生英光信号。所 W，每经过一个PCR循环，英光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号 的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
[0077] 本发明有益效果：
[0078] 1)本试剂盒主要针对宫颈脱落细胞悬浮液中的乳头瘤病毒核酸的定性检测，并采 用人类看家基因为内标对整个HPV检测过程进行监控，有效地避免了样本在采集、运输保 存W及在提取过程中的操作不当而造成的假阴性，并可反映样本中宫颈脱落细胞含量，可 对HPV相对病毒载量进行推算；
[0079] 2)本发明采用英光-PCR法，并能够同时检测24种型别（18种HPV高危型别和6 种 HPV 低危型别即 HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82、6、 11、40、42、43、44)，有效地避免了膜杂交法开盖杂交容易污染，并能够有效地提高样本处理 通量。
[0080] 3)本发明对我国分布较普遍的6、11、16、18、31、33、45、52、58型单独分型的检测， 即同时能够准确分辨出：低危型别6、11 ;高危型别16、18、52、58、31、33、45，共计9种型别。 其中，6、11均为性病常见的感染型别，16、18、52、58、31、33、45为中国最为常见的高位感染 型别，送些型别的分辨对于临床有重要的指导意义。
[0081] 4)本发明所采用的引物探针设计均在E区进行设计，有效地避免了现阶段在L1区 设计而造成的漏检。
【附图说明】
[0082] 下面结合附图与【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明：
[008引图1是HPV 16、31、6型的1. ΟΧΙΟ3拷贝数/ml分型参考品的扩增曲线；
[0084] 图2是HPV 18、33、11型的1.0X103拷贝数/ml分型参考品的扩增曲线；
[00财图3是HPV 45、52型的1. 0X 103拷贝数/ml浓度的扩增曲线；
[0086] 图4是HPV 16型重组质粒梯度稀释英光PCR扩增曲线，曲线由左到右对应的样本 拷贝数分别为IX 1〇7拷贝数/ml, IX 1〇6拷贝数/ml, IX 1〇5拷贝数/ml, IX 104拷贝数/ml, 1X 1〇3拷贝数/ml, 1X 1〇2拷贝数/ml ;
[0087] 图5是试剂盒检测HPV阴性样本的内标扩增曲线；
[008引图6是试剂盒检测HPV阴性样本的祀标扩增曲线；
[0089] 图7是1号混合感染样本扩增曲线；
[0090] 图8是2号混合感染样本扩增曲线。
【具体实施方式】
[0091] 第一实施方式
[0092] 本实施例中提供了一种人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，可W对高危型别和低危型 别的人乳头瘤病毒（HPV)的感染情况进行定性检测，如可对16、18、52、58、31、33、45、6、11 进行型别检测，同时也可对 35、39、51、53、56、59、66、68、73、82、26、40、42、43、44 进行检测。 该试剂盒可用于临床HPV感染的辅助诊断和宫颈癌的早期筛查。
[0093] 1、试剂盒A ;保存温度；2~8°C
[0094] 表3核酸提取试剂
[0095]
[0096] 其中，裂解液是含异硫氯酸脈和TritonX-100的溶液，或者该裂解液是含异硫 氯酸脈和Tween-20的溶液；其中，裂解液中的异硫氯酸脈的浓度为4M，TritonX-100或 Tween-20的体积浓度为1. 5% ;
[0097] 结合液，其配制方法为：取200g高氯酸钢、30g醋酸钢溶解于少量纯化水中，然后 加入500ml无水己醇，并用纯化水定容至1L即可。
[0098] 蛋白酶 K ;夕['购于 Roche 公司，5-10 μ L/sample。
[0099] RNA 的聚合酶 A (Poly A);外购于 chemagen 公司，5-10 μ L/sample。
[0100] 磁珠悬浮液；chemagen公司的顺磁性氧化娃纳米磁珠的悬浮液（磁珠为购自 chemagen公司的M-PVA011型号的磁珠）。
[0101] 洗液A，其配制方法为：取250g高氯酸钢、50g的醋酸钢、溶解于少量纯化水中，然 后加入450ml无水己醇，并用纯化水定容至1L即可。
[0102] 2、试剂盒B ;保存温度；-18°C W下
[0103] 表4核酸扩增试剂
[0104]
[0105] 上述核酸扩增试剂中，一些组分的配制如下：
[0106] HPV反应液A是通过盐缓冲液将MgClz和dNTPs溶解而形成的，其中，MgClz的终浓 度为150mM, dNTPs的终浓度为0. 5mM,盐缓冲液是含20mM抑8. 8Tris-肥l、50mM KC1水溶 液。
[0107] 册￥英光反应液81;册￥16、18、52、58、内标（1〇的引物对（569 10側.1-2、3-4、 19-20、27-28、73-74)和其型别对应的探针（SEQ ID NO. 49、50、58、62、75)，各对引物浓度为 80nmol/L，探针浓度为 20nmol/L ;
[010引 HPV 英光反应液 B2 ;HPV31、33、45、35、39、51、53、56、59、66、68、73、82、26、内标 (1C)的引物对（SEQ ID NO. 9-10、11-12、17-18、13-14、15-16、35-36、21-22、23-24、29-30、 25-26、31-32、39-40、33-34、37-38、73-74)和其型别对应的探针（569 10側.53、54、57、55、 56、66、59、60、63、61、64、68、65、67、75)，各对引物浓度为 80皿01/1，探针浓度为 20nmol/L ;
[0109] HPV 英光反应液 B3 ;HPV6、11、40、42、43、44、内标（1C)的引物对（SEQ ID NO. 5-6、 7-8、41-42、43-44、45-46、47-48、73-74)和其型别对应的探针（SEQ ID NO. 51、52、69、70、 71、72、75)，各对引物浓度为80nmol/l，探针浓度为20nmol/L ;
[0110] 其中，沈Q ID NO. 49-72用于HPV祀标的检测，探针沈Q ID NO. 75用于检测人类 看家基因。
[01U] 如沈Q ID NO. 49、51、53所示的探针（分别针对HPV16、HPV6和HPV31型的特异性 探针）的5'端使用R0X英光基团标记；
[0112] 如沈Q ID NO. 50、52、54所示的探针（分别针对HPV18、HPV11和HPV33型的特异 性探针）的5'端使用CY5英光基团标记；
[011引如SEQ ID NO. 57、62所示的探针（分别针对HPV45和HPV58型的特异性探针）的 5'端使用肥X英光基团标记；
[0114] 如沈Q ID NO. 55-56、58-61、63-72 所示的探针（分别针对 HPV35、HPV39、HPV52、 HPV53、HPV56、HPV66、HPV59、HPV68、HPV82、HPV51、HPV26、HPV 73、HPV40、HPV42、HPV43、 HPV44型的特异性探针）的5'端使用FAM英光基团标记；
[0115] 如SEQ ID NO. 49-72、75所示的探针的3'端使用B册1浑灭基团进行标记。
[0116] 如SEQ ID NO. 75所示的内标探针的5'端标记有TAMARA英光基团。
[0117] 阴性对照品：由HPV病毒阴性的脱落宫颈细胞保存液配制为阴性对照品，监控样 本测试过程的准确性。
[011引 阳性对照；是由册￥多型别化口￥6、11、16、42、18、52、58、31、33、45或53型别）临 床样本配制的浓度为5 X 104拷贝数/ml的阳性对照品，监控样本测试过程的准确性。
[0119] 本试剂盒采用多重PCR英光检测法，能同时检测宫颈脱落细胞中的18种高危型 别（HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82)和 6 种低危型别 (HPV6、11、40、42、43、44)。
[0120] W下实施例中使用上述试剂盒做性能指标测试。
[0121] 一、样本准备
[0122] 1、采样
[0123] 本试剂盒可对人宫颈脱落细胞中的HPV进行检测。医护人员W专业的设备打开阴 道，暴露出宫颈，用棉拭子清理宫颈口过多的分泌物。用宫颈刷插入到宫颈口（宫颈刷的刷 头既要保证充分插入到宫颈口，但又不能插入太深，W刷头最外层的刷毛能接触到外宫颈 为最佳），顺时针旋转3-5周获得足量的脱落细胞样本，然后取出宫颈刷，并将其刷头插入 到保存液管底，使刷头完全浸入保存液中，旋紧管盖。
[0124] 2、标本保存
[0125] 样本采集后，需尽快送检测试。标本室温保存不超过24小时；4°C保存不超过一 周；-2(TC保存不超过Η个月；如样本需长期保存，应放置于-7(TCW下环境保存，需避免反 复冻融样本。
[0126] 3、标本运输
[0127] 在运输过程中需保证试剂盒的保存温度，可利用冰袋保持较低的温度。
[0128] 二