流行病学分类，存在15种高危和5种低危病毒基因型（Munoz N等人，2003, N Engl J Med.，348, 518-527)。公认几乎100%的侵袭性子宫颈癌和高级别 癌前上皮内瘤形成与由高危HPV感染的感染相关。这是关于使用高危HPV检测用于筛选女 性和鉴定处于子宫颈癌后续发展的危险中的个体的基本原理。
[0029] 因为HPV不能在体外培养并且血清学测定仍是无效的，所以HPV感染的诊断基 于分子工具的使用。直接斑点检测（direct dot-spot detection)和原位杂交测定已 得到描述（Melchers WJ 等人，1988, J Med Virol25 :11-16 ;Melchers WJ，1989, J Clin Microbiol，27:106-110)，但这些方法是冗长的且看起来缺乏灵敏度和特异性。DNA扩增 法例如聚合酶链反应（PCR)允许病毒DNA的更灵敏检测。除用于个别HPV基因型的类型 特异性 PCR 引物外（Baay MF 等人，1996，J Clin Microbiol，34:745_747;van den Brule 八了等人，1989，116(1￥化〇1，29:20-27)，几种通用？〇?引物组已得到开发，包括1^11/ MY09(Manos MM 等人，1989, Cancer Cells，7:209-214)、0BI/II(Jenkins A，等人 1991， APMIS，99:667-673)、CPI/CPIIG(Tieben LM 等人，1993, J Virol Methods，42:265-279)、 GP5+/6+(de Roda Husman AM 等人，1995, J Gen Virol，76 :1057-1062)、SPF 引物（Kleter B 等人，1998, Am J Pathol. Dec; 153 (6) :1731-9)和衍生自 SPF 引物的 HP 引物（Payan C 等人，2007, J Clin Microbiol，45(3) :897-901)。所有这些引物都旨在检测所有HPV亚型， 伴随使用特异性探针的高危型与低危的后续鉴别。类似地，存在公开了用于检测临床样品 中的HPV的引物和探针的众多授权的专利（6, 583, 278,2003年6月，Carter ;Ν. Μ. (E6和 E7) ;6, 503, 704, 2003 年 1 月，Mahony 等人（LI) ;6, 355, 424, 2002 年 3 月，Lorincz，等人； 6, 228, 577, 2001 年 5 月，Mahony，等人；6, 218, 104, 2001 年 4 月，Morris，等人；6, 045, 993， 2000 年 4 月，Mahony，等人；5, 888, 724,1999 年 3 月，Silverstein，等人；5, 783, 412,1998 年 7 月，Morris，等人；5, 705, 627,1998 年 1 月，Manos，等人；5, 639, 871，1997 年 6 月，Bauer，等 人；5, 527, 898,1996 年 6 月，Bauer，等人；5, 447, 839,1995 年 9 月，Manos，等人；5, 283, 171， 1994 年 2 月，Manos，等人；5, 182, 377,1993 年 1 月，Manos，等人；5, 501，947,1996 年 3 月， Emery，等人）。
[0030] 本发明提供了所有形式的检测HPV的引物和探针：（i)仅使用核酸（NA)扩增或其 他分析法直接检测最频繁的高危型，（ii)使用2步过程（NA扩增连同产物通过杂交的后续 分析）直接检测最频繁的高危型，和（iii)在单一反应中扩增和分析高和低危HPV类型。本 发明进一步提供了用于设计和使用对HPV的El基因区域特异的寡核苷酸引物的方法。关 键地，本发明的组合物和方法解决了用于检测、筛选和监控与HPV感染相关的疾病的长期 需要。
[0031] 用于HPV筛选的目前可用测试的缺点之一是DNA的来源，即子宫颈细胞。从患者中 收集子宫颈细胞需要到医生办公室的就诊和至少受过训练的技术员但更可能地持有执照 的医生执行样品收集。此外，该程序对于患者是侵袭性且不舒服的。暗示收集子宫颈细胞 的前述障碍可以是美国约30%的女性在常规基础上无巴氏涂片检查的原因 （Ackermann SP 等人，1992，MMWR CDC Surveill Summ，41 :17-25 ;Anderson，LM，May DS. 1995，Am J Public Health，85 :840-2)。进一步地，存在限制女性到妇科医生办公室的就诊用于子宫颈取样和 一般阴道检查的宗教和其他文化原因。
[0032] 本发明提供了解决关于子宫颈细胞收集的上述障碍的解决方案。本发明的方法 使用不同来源的HPV DNA，其不需要子宫颈刮术。相反，本发明的组合物和方法检测得自患 者的尿样品中的HPV DNA。HPV DNA在离心的尿（Payan C等人，2007, J Clin Microbiol， 45(3):897-901 ;Forslund 0,等人，1993, J Clin Microbiol，31(8):1975-9;Song ES等人， 2007，J Korean Med Scl，22(l) :99-104)或全尿（50,51，52Brinkman JA等人，2002, J Clin Microbiol，40(9):3155-61;Sellors JW 等人，2000, CMAJ.163(5):513-8;Smits PH 等人， 2005, J Clin Microbiol. 2005,43(12) :5936-9)的细胞沉淀中检测出。然而，先前公开的 测试是基于PCR的。这些报道中的临床灵敏度是不令人满意的，这是由于范围为100 - 500 个碱基对（bp)的扩增引物（amplimers)大小。
[0033] 目前，本领域公认在尿中出现的NA来自2个来源，（i):从泌尿生殖道脱落到尿内 的细胞，其NAs通常是高分子量的，和（ii)跨越肾屏障从血流到尿内的经肾NAs (Tr-DNA)， 其通常是低分子量片段。低分子量经肾NA大小范围为约20-150bp (Chan KC等人，2008， Clin Cancer Res·，14(15) :4809-13 ;Su YH，等人，2004, Ann N Y Acad Sci，1022:81-9; Umansky SR，Tomei LD.2006，Expert Rev Mol Diagn.，6(2) :153-63)。扩增子大小的减少使 测试灵敏度增加 10 倍（Melkonyan HS 等人，2008, Ann. Ν·Υ· Acad. Sci. 1137 :73-81)。因此， 本发明提供了用于设计和使用靶向非常短（约30 - 50bp)扩增子的寡核苷酸引物的方法。 本发明的寡核苷酸引物组合物有效地检测尿中从脱落细胞释放的HPV DNA以及Tr-DNA。
[0034] 关键地，本发明的寡核苷酸引物组合物靶向在HPV的El基因中新近鉴定的高度特 异性遗传标记（表1)。靶向El基因内的这种标记允许设计PCR引物和探针用于特异性检 测临床或生物学样品中的尚危HPV基因型。本发明还提供了基因定位到El基因区域的尚 危HPV特异性引物，其扩增非常短的DNA片段，以检测尿的Tr-DNA级分中存在的HPV基因 组片段。
[0035] 选自表1中指定的HPV的El基因区域的寡核苷酸或互补序列用于生物学或临床 样品中的 HPV 检测。此外，具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 95%、100%同源性或同一性或之间的任何百分比点的寡核苷酸或互补序列用于生物学或 临床样品中的HPV检测。使用下述示例性技术从生物学或临床样品中检测HPV，包括但不 限于，聚合酶链反应（PCR)和这种方法的所有变形；实时PCR ;NA杂交；环状探针反应；单链 构象多态性（SSCP);链置换扩增（STA);限制性片段长度多态性（RFLP)，和涉及纳米技术的 NA分析技术。引物可以与结合位点杂交，所述结合位点在靶序列上彼此紧密相邻或略微重 叠（在引物结合位点之间不具有间插序列）。
[0036] 进一步地，选自HPV的El基因区域的寡核苷酸（在表1中提供）通过逆转录PCR 反应检测El基因的特异性RNA转录物。本发明的生物学和临床样品包括但不限于在体内 的任何流体，包括血液、尿、唾液、痰、眼泪、精液、乳或阴道分泌物。在本发明的优选实施方 案中，生物学或临床样品是尿。
[0037] 由本发明进一步包含的是用于检测HPV的诊断试剂盒，其包括：促进从尿中分离 长度20-500个核苷酸的DNA的试剂；促进通过聚合酶链反应扩增长度20-500个核苷酸的 DNA的试剂；热稳定的DNA聚合酶；和对于仅出现于HPV的El基因中的标记序列特异的寡 核苷酸。
[0038] 对于本发明的实践有用的核酸操作技术在多种参考文献中描述，包括但不限于 Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第 2 版，第 1-3 卷，编辑 Sambrook 等人 Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989);和 Current Protocols in Molecular Biology, 编辑 Ausubel 等人，Greene Publishing and Wiley-Interscience :New York (1987)和定 期更新。具体描述虽然不意图限制本发明的范围，但提供在实践本发明的特定方面中的指 导。
[0039] DNA经历体液例如尿中存在的DNA酶的降解。本发明包含用于预防或减少DNA在 尿中时的降解的几种方法，从而使得足够大的序列可用于通过已知DNA检测法的检测，例 如下文描述的那些。在一个实施方案中，当尿已在膀胱中保留小于12小时时获取尿样品， 在具体实施方案中，尿在膀胱中保留小于5小时、更优选小于2小时。在其已在膀胱中保留 长时间段前收集且分析尿样品减少DNA对尿中存在的任何DNA酶的暴露。
[0040] 在本发明的另一个实施方案中，在收集后，使用抑制DNA酶活性的一种或多种方 法处理尿样品。抑制DNA酶活性的方法包括但不限于使用乙二胺四乙酸（EDTA)、盐酸胍、 GITC (异硫氰酸胍）、N-月桂酰基肌氨酸、十二烷基硫酸钠（SDS)、高盐浓度和DNA酶的热灭 活。
[0041] 在另外一个实施方案中，在收集后，用捕获DNA的吸附剂处理尿样品，这之后从样 品中去除吸附剂，漂洗且处理以释放捕获的DNA用于检测和分析。这种方法不仅从尿样品 中分离DNA，而且当与一些吸附剂一起使用时，还保护DNA不受DNA酶活性的降解，所述吸附 剂包括但不限于 Hybond N 膜（Amersham Pharmacia Biotech Ltd.，Piscataway，NJ. ) 〇
[0042] 在某些情况下，尿样品中的DNA量是有限的。因此，对于特定应用，本发明包含其 中检测灵敏度通过本领域已知的任何一种或多种方法得到增加的实施方案，包括但不限于 下述方法中的一种或多种。
[0043] 当DNA以微小量存在于尿中时，可以收集较大的尿样品且其后通过任何方法进行 浓缩，所述任何方法不影响样品中存在的DNA的检测。一些例子在不限制本发明的宽度的 情况下包括，通过丁醇浓缩或使用 Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway N.J.)的浓缩减少样品中存在的液体。
[0044] 嵌套式PCR可以用于使灵敏度改善几个数量级。因为嵌套式PCR易由于DNA污染 而产生不准确结果的弱点，所以在本发明的一个实施方案中，要小心避免样品的DNA污染。 例如但不限制本发明，在将PCR试剂添加到测试DNA样品中前，人们可以用在靶序列内切割 的一种或多种限制性核酸内切酶处理PCR试剂。
[0045] 在一个实施方案中，本发明包含在检测前从样品中基本上纯化或分离核酸。核酸 分子可以使用许多程序中的任何一种从尿中分离，所述程序是本领域众所周知的。促进靶 核酸检测的用于分离的任何方法都是可接受的。例如，DNA可以通过沉淀进行分离，如由 Ishizawa等人，Nucleic Acids Res. 19,5972(1991)描述的。当大体积样品包含低浓度DNA 时，正如尿的情况一样，包含分离DNA的优选方法。在这种方法中，用吸附剂处理样品，所述 吸附剂作用于使DNA浓缩。例如，样品可以用将吸附DNA的固体材料进行处理，例如但不限 于 DEAE Sephadex A-25 (Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway N. J. )、DNA 滤器和 / 或玻 璃乳（glass milk)。在其他组合物被洗掉后从吸附剂中洗脱样品DNA。
[0046] 考虑到各种核酸分析技术例如PCR的灵敏度，本发明还包含减少尿样品中污染性 核酸的存在的方法。尿样品由未跨越肾屏障的核酸序列的污染可以通过从尿道衬里脱落的 细胞、通过性交、或在检测目的DNA序列前在尿样品处理过程中引入。不意图使本发明限制 于任何机制，认为经过肾屏障且在尿中出现的DNA可能平均具有比由污染来源引入的DNA 更短的长度，这是由于在体内凋亡细胞和坏死细胞中出现的断裂，与血液和尿