一种发酵生产重组牛虻抗血栓酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制药技术领域，涉及重组牛虻抗血栓酶kfpase的发酵制备方法。
【背景技术】
[0002]血栓栓塞性疾病严重影响人类的健康，是导致死亡率最高的病因之一。在过去的几十年中，已经开发了针对血液凝固、血小板激活和聚集、血栓溶解的不同步骤而起作用的基础和临床药物，但是很多抗血栓药物经常被包括低血压、出血等系统性的副作用所限制，因此，需要开发新型的更具潜力和特异性的抗血栓药物。
[0003]牛虻抗血栓酶kfpase为一种单链蛋白，其表观分子量为27kDa。实验表明牛虻抗血栓酶kfpase能水解纤维蛋白原和抑制血小板聚集，能抑制角叉菜胶诱导的鼠尾静脉血栓形成，且无出血活性。应用于ADP诱导的人血小板聚集试验具有明显的抗血小板聚集的作用。该工作对有潜力开发成为新型单组份抗血栓药物的牛虻抗血栓酶kfpase进行了较为系统的理化性质研究，为该酶的进一步开发和研究奠定了基础。
[0004]大肠杆菌是基因工程中常用的宿主菌，许多有价值的蛋白在大肠杆菌中已成功地进行了表达，且外源蛋白表达量较高。大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，由于具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，技术操作、培养条件简单、抗污染能力强、大规模发酵成本低等优点，倍受遗传工程专家重视，是目前应用最广泛，最成功的表达体系。本发明提供的发酵方法使得重组牛虻抗血栓酶kfpase的蛋白表达量在IPTG诱导表达3h后就能够达到总蛋白的30%以上。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种发酵生产重组牛虻抗血栓酶kfpase的方法，包括:(I)构建含牛虻抗血栓酶目的基因的高效表达工程菌株，(2) 一级种子的培养，(3) 二级种子的培养，(4)上罐发酵，(5)离心发酵液收集菌泥，进行纯化。其特征在于，在上罐发酵过程中，参数设置为PH值为6.5-8.0，溶氧值为不小于20%，生长温度为30°C _37°C，诱导期温度为250C _37°C。通过该方法可以有效地表达重组牛虻抗血栓酶，该方法具有操作简单，蛋白表达量高，周期短等特点。
[0006]本发明提供的技术方案为提供一种发酵生产重组牛虻抗血栓酶kfpase的方法，包括:(1)构建含牛虻抗血栓酶目的基因的高效表达工程菌株，(2) 一级种子的培养，(3) 二级种子的培养，(4)上罐发酵，(5)离心发酵液收集菌泥，进行纯化。其特征在于，在上罐发酵过程中，参数设置为pH值为6.5-8.0，溶氧值为不小于20%，生长温度为30°C _37°C，诱导期温度为25°C -37°C。
[0007]本发明提供的发酵方法适用于常规分子生物学技术构建的kfpase工程菌株。具体地，本发明提供的工程菌为，将kfpase基因正确置于酵母表达载体pet30a，转化大肠杆菌BL21 (DE3)，经筛选建立表达kfpase的工程菌株。然后经过常规的生产技术，进行菌株的活化，即将冻存的甘油管菌株，挑取少许在固体培养基(LB)上划线，37°C培养12-16h，长出大小适宜的单菌落，取出4°C保存。
[0008]一级种子的制备，挑取平板单菌落接种到三角摇瓶中，培养基为LB，37°C，200rpm，培养 7-9h0 0D600 为 1-2。
[0009]二级种子的制备，以I %的接种量接种二级种子，培养基为LB，37°C，200rpm，培养14-18h。0D600 为 3-5。
[0010]上罐发酵过程:
[0011](I) 4.5发酵培养基组成
[0012]称取glucose22.5g, yeast extract49.5g, tryptone85.5g, MgS044.5g,KH2PO413.5g, K2HPO4.3H2081g, (NH4) 2S0418g，溶于 4L 水中，定容 4.5L。
[0013](2)待发酵罐灭菌，降温至37°C，调整参数，PH值为7.0，按2%的接种量接种；
[0014](3)生长阶段，在基础料中生长3_5h，待培养基中的初始糖耗尽后，补50%葡萄糖溶液4-6h ；
[0015](4)诱导期，停止补葡萄糖，待葡萄糖耗尽，溶氧上升，PH回升后，添加终浓度为0.1mM-0.8mM的IPTG。通过50%葡萄糖溶液的间歇流加来控制pH值稳定在7.0左右。
[0016](5)发酵过程中，工艺参数的控制为:pH值为6.5-7.5，溶氧值为不小于20%，生长期温度和诱导期温度为37°C。
[0017]本发明使用的发酵罐为NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC C0.公司生产的B1FlollO型发酵罐。本发明提供的发酵生产重组kfpase的工艺，适用于市场上出售的任何厂家生产的发酵罐。
[0018]离心发酵液收集菌泥，超声破碎，进行产物的检测，结果如图1所示，经过SDS-PAGE法检测，重组kfpase蛋白表达量达到总蛋白30%以上。
【附图说明】
[0019]附图重组牛虻抗血栓酶发酵过程不同时间取样电泳图(1:诱导前样品2:诱导I小时样品3:诱导2小时样品4:诱导3小时样品5:诱导4小时样品)
【具体实施方式】
[0020]实施例1工程菌株的构建
[0021]利用常规的DNA重组技术将kfpase基因正确置于大肠杆菌表达载体pet30a,转化大肠杆菌菌株BL21 (DE3)，经筛选建立分泌表达kfpase的工程菌株。
[0022]实施例2工程菌株的活化
[0023](I)平板培养基的组成:含1%的蛋白胨，0.5%的酵母粉，1%的氯化钠，2%的琼月旨，40ug/ml卡那霉素。
[0024](2)冻存的甘油管菌株，挑取少许涂入上述的培养基中，37°C培养14_16h，待长出大小适宜的单菌落，取出4°C保存。
[0025]实施例3 —级种子的制备
[0026](I)培养基的组成:1%的蛋白胨，0.5%的酵母粉，1%的氯化钠，40ug/ml卡那霉素。
[0027](2)挑取平板种子接种上述的三角瓶培养基，37°C，200rpm，培养811。00600为2.0。
[0028]实施例4 二级种子的制备
[0029](I)培养基的组成:1%的蛋白胨，0.5%的酵母粉，1%的氯化钠，40ug/ml卡那霉素。
[0030](2) 一级种子，以I %的接种量接种制备二级种子，370C，200rpm,培养15h。0D600为 4.0。
[0031]实施例5上罐培养
[0032](I) 4.5L发酵培养基组成
[0033]称取glucose22.5g, yeast extract49.5g, tryptone85.5g, MgS044.5g,KH2PO413.5g, K2HPO4.3H2081g, (NH4) 2S0418g，溶于 4L 水中，定容 4.5L。
[0034](2)待发酵罐灭菌，降温至37°C，调整PH值为7.0，罐上的控制参数调整好后，按2%的接种量接种。
[0035](3)生长阶段
[0036]接种后，前2h为适应期，在次过程中，发酵参数变化不明显，pH值慢慢降低，低于7.0时通过自动流加30%氨水来控制pH值在7.0左右；2小时后溶氧开始快速下降，当溶氧值低于20%时，通过搅拌的提升和通空气量的增加，来满足需求，必要时通纯氧以维持20%的溶氧值。在基础料中生长4h左右，培养基中的初始糖消耗完，溶氧快速上升，pH值明显回升，指数流加50%葡萄糖溶液约5h。
[0037](4)诱导期
[0038]停止补葡萄糖，待溶氧上升，PH回升后，添加IPTG至终浓度为0.5mM。诱导重组牛虻抗血栓酶表达时通过缓慢间歇式流加50%葡萄糖溶液来调节pH值在7.0左右。
[0039](5)离心发酵液，收集菌泥，用于纯化。
[0040]实施例6检测结果及结论
[0041]取适量菌泥，使用pH8.020mM Tris-HCl重悬后超声破碎，经过SDS-PAGE法检测，如图1重组牛虻抗血栓酶发酵过程不同时间取样电泳图所示，重组牛虻抗血栓酶蛋白表达量在诱导3h后就达到高峰，且重组牛虻抗血栓酶占总蛋白表达量的30%以上。
【主权项】
1.一种发酵生产牛虻抗血栓酶的方法，包括:(1)构建含牛虻抗血栓酶目的基因的高效表达工程菌株，(2) —级种子的培养，(3) 二级种子的培养，(4)上罐发酵，(5)离心发酵液收集菌泥，进行纯化，其特征在于，在上罐发酵过程中，参数设置为PH值为6.5-7.5，溶氧值为不小于20%，生长温度为30°C _37°C，诱导期温度为25°C _37°C。
2.如权利要求1所述的发酵生产牛虻抗血栓酶的方法,其中，将kfpase基因正确置于大肠杆菌表达载体pet30a，转化大肠杆菌BL21 (DE3)，经筛选建立分泌表达kfpase的工程菌株。
3.如权利要求1所述的发酵生产牛虻抗血栓酶的方法，其中，一级种子的制备，挑取平板种子接种到三角瓶培养基，培养基为LB，37°C，200rpm，培养7_9h，0D600为1-2。
4.如权利要求1所述的发酵生产牛虻抗血栓酶的方法，其中，二级种子的制备，以1%接种量接种三角瓶培养基，培养基为LB，37°C，200rpm，培养14_18h，0D600为3-5。
5.如权利要求1所述的发酵生产重组牛虻抗血栓酶的方法，其中，上罐发酵过程中: (1)4.5发酵培养基组成称取 glucose22.5g, yeast extract49.5g, tryptone85.5g, MgS044.5g, KH2PO413.5g,K2HPO4.3H2081g，(NH4)2S0418g，溶于 4L 水中，定容 4.5L ； (2)待发酵罐灭菌，降温至37°C，调整参数，PH值为7.0，按2%的接种量接种； (3)生长阶段，在基础料中生长3-5h，待培养基中的初始糖耗尽后，补50%葡萄糖溶液4_6h ； (4)诱导期，停止补葡萄糖，待葡萄糖耗尽，溶氧上升，PH回升后，添加终浓度为0.1mM-0.8mM的IPTG。通过50%葡萄糖溶液的间歇流加来控制pH值稳定在7.0左右； (5)发酵过程中，工艺参数的控制为:pH值为6.5-7.5，溶氧值为不小于20%，生长期温度和诱导期温度为37°C。
6.如权利要求1所述的发酵生产重组牛虻抗血栓酶的方法，其中，将发酵液离心，收集菌泥，进行纯化。
【专利摘要】本发明属于生物发酵领域，提供了一种发酵生产重组牛虻抗血栓酶的方法。此法包括：(1)构建含牛虻抗血栓酶目的基因的高效表达工程菌株，(2)一级种子的培养，(3)二级种子的培养，(4)上罐发酵，(5)离心发酵液收集菌泥，进行纯化。通过本发明提供的发酵方法，能使重组牛虻抗血栓酶获得高效表达。
【IPC分类】C12R1-19, C12N9-68
【公开号】CN104630191
【申请号】CN201310560274
【发明人】秦引林, 庄韬
【申请人】江苏柯菲平医药股份有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年11月12日