本发明涉及一种蛋清蛋白-儿茶素自由基接枝物的制备方法，属于食品技术领域。
背景技术：
随着食品工业的不断发展，对具有特定功能特性及营养特性的蛋白质的需求也在不断的提高。蛋清蛋白具有优异的营养和感官特性，广泛应用于食品中。通过物理、化学以及生物手段赋予蛋清蛋白具有抗氧化性和更好的功能性质，可进一步拓宽其在食品、生物和医药等领域中的应用。儿茶素是茶多酚中一类具有高活性的类黄酮的总称，具有很强的抗氧化功能。但是通过混合法或者碱法制备蛋清蛋白-儿茶素复合物，蛋白质与多酚相互作用较弱，不足以显著提高蛋白质的抗氧化性。因此亟需采用新的技术手段促进蛋白质和多酚分子之间的相互作用，形成具有强抗氧化性的复合物。
接枝聚合技术常用于开发具有特定理化结构的新型材料，可赋予天然或合成高分子材料新的功能性质，从而进一步拓宽其在各领域的应用。接枝聚合的目的是将一些具有特定功能特性的小分子物质接枝到高分子结构上获得新型复合物，兼具两种物质的功能性质。在接枝聚合研究中，引发剂的选择是聚合的关键，在众多引发剂中，一种不含金属元素的氧化还原引发体系一一抗坏血酸和过氧化氢体系正逐步引起人们的重视。该体系操作简单，条件温和，常温下即可进行，而且不会产生有毒副产物，在对安全性要求苛刻的食品领域具有十分重要的意义。
抗坏血酸和过氧化氢体系在合成蛋白-多酚复合物方面，目前还处于基础研究的初始阶段，在自由基存在的条件下蛋白质与多酚之间的相互作用机理及该复合物在实际应用体系中的功效等研究很少，国内外也还没有相关专利。现有的研究主要是采用乳铁蛋白、β-乳球蛋白、卵转铁蛋白等单一蛋白为主要原料。但这类蛋白原料价格高，来源稀少，生产成本太高，限制其在实际生产中的应用。此外，由于蛋白来源不一样，与多酚的相互作用也就不一样，如何提高蛋白-多酚复合物产品的性能也是目前急需解决的问题。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了简单快速提高蛋清蛋白的抗氧化性的方法，是一种蛋清蛋白-儿茶素自由基接枝物的制备方法。本发明方法以蛋清蛋白为原料，加入抗坏血酸和过氧化氢体系作为自由基引发剂，蛋白分子在羟基自由基作用下形成活性分子，有利于与儿茶素小分子相互作用形成具有强抗氧化性的蛋清蛋白-儿茶素自由基接枝物。而且蛋清蛋白具有原料来源广泛、价格低廉、营养丰富等优势，市场前景广泛。
本发明的蛋清蛋白-儿茶素自由基接枝物的制备方法，所述方法包括：先先预处理蛋清以除去蛋清中的粘蛋白，在蛋清溶液中加入自由基引发剂，然后添加儿茶素形成蛋清蛋白-儿茶素自由基接枝物，再对样品溶液进行透析处理以确保未反应的游离儿茶素已完全去除，最后冷冻干燥后得到产品。
在本发明的一种实施方式中，所述蛋清预处理为：在蛋清中加入9倍体积的水稀释，最终蛋白质量分数为1％，调节pH至5.0左右，搅拌10-20min，自然沉淀1h，然后过滤去除不溶的蛋白成分。
在本发明的一种实施方式中，所述儿茶素与蛋清溶液中的蛋白的质量比为1:20～1:5。
在本发明的一种实施方式中，所述儿茶素的终浓度为0.5～2g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述自由基引发剂为过氧化氢和抗坏血酸。
在本发明的一种实施方式中，所述过氧化氢的终浓度为0.05～0.2mol/L，抗坏血酸的终浓度为1.25～10g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述蛋清蛋白溶液的体积为50mL；所述自由基引发剂为0.5-2.0mL 5M过氧化氢和0.0625-0.5g抗坏血酸。
在本发明的一种实施方式中，所述自由基引发剂与蛋清蛋白的反应条件是25℃，2h。
在本发明的一种实施方式中，所述儿茶素的添加量是0.025-0.1g。
在本发明的一种实施方式中，所述儿茶素与蛋清蛋白的反应条件是25℃，12～48h。
在本发明的一种实施方式中，所述透析处理是在4℃条件下继续。
在本发明的一种实施方式中，所述透析处理是透析12-60h，每隔6h换水一次。
在本发明的一种实施方式中，所述制备方法，具体包括：在蛋清中加入9倍体积的水稀释，最终蛋白质量分数为1％，调节pH至5.0左右，搅拌10-20min，自然沉淀1h，然后过滤去除不溶的蛋白成分。取50mL蛋清溶液于100mL三角瓶中，加入0.5-2.0mL 5M过氧化氢和0.0625-0.5g抗坏血酸，搅拌均匀后置于室温下2h，再加入0.025-0.1g儿茶素，25℃条件下反应12-48h，再对样品在4℃下进行透析12-60h(若是室温条件进行透析，超过24h，蛋白将变性沉淀)，每隔6h换水一次以确保未反应的游离多酚完全透析出去，最后冷冻干燥后得到样品。
本发明还要求保护所述方法得到的蛋清蛋白-儿茶素自由基接枝物，以及所述蛋清蛋白-儿茶素自由基接枝物在食品方面的应用。
本发明制备的蛋清蛋白-儿茶素自由基接枝物需在4℃条件下进行透析。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用的自由基接枝法操作简单，条件温和，而且不会产生有毒副产物。
(2)与蛋清蛋白和碱法制备的复合物相比，本发明制备的蛋清蛋白-儿茶素自由基接枝物，其抗氧化性得到显著提升，其DPPH自由基清除率为65.29％，ABTS自由基清除率为94.17％，还原力最高可达0.649Abs。
(3)与已报道的明胶-儿茶素自由基接枝物的制备方法，本发明采用的自由基引发剂和儿茶素的添加量较少，即可达到明胶-儿茶素自由基接枝物的抗氧化性。在相同工艺条件下，本发明采用蛋清蛋白为主要原料制备的蛋白-儿茶素具有更高的抗氧化性。
具体实施方式
(1)DPPH自由基清除能力的测定
称取DPPH粉末4mg，用无水乙醇溶解并定容至100mL，配制成最终浓度为0.1mM的DPPH乙醇溶液，放置于棕色瓶中，并保存在暗处备用。将样品稀释适当倍数，使样品进行分析时其吸光值最好在0.7以下为准。取2mL DPPH乙醇溶液与2mL样品(1mg/mL)在具塞试管中混合，混合后及时放置暗处，30min后于517nm处测定吸光度值，同时以无水乙醇作为空白对照，实验重复三次，并按下式计算DPPH自由基的清除率：
式中，A0空白为空白样在517nm处的吸光值，A为待测样品在517nm处的吸光值。
(2)ABTS+·清除能力的测定
将7mM ABTS溶液和2.45mM过硫酸钾溶液等体积混合制成ABTS工作母液，室温避光存放16h，使用前用5mM pH 7.4磷酸盐缓冲液进行稀释，要求ABTS工作液的吸光度减去磷酸盐缓冲液空白对照后，为0.70±0.02。准确量取2.5mL样品溶液(0.5mg/mL)与2.5mL的ABTS工作液混匀，室温反应15min后测定其在734nm波长下的吸光值，同时以磷酸盐缓冲液作为空白对照，平行试验三次。ABTS+·清除率的计算公式如下：
式中：A0为空白样与ABTS+·反应后的吸光值；A为样品与ABTS+·反应后的吸光值。
(3)铁离子还原能力的测定
量取1.0mL样品液(10mg/mL)，加入0.2moL/L的磷酸盐缓冲液(pH 6.6)2.5mL和1％的铁氰化钾溶液2.5mL，混合物于50℃水浴保温30min，然后加入2.5mL 10％(w/v)三氯乙酸溶液，在3000g转速下离心10min，准确移取上清液2.5mL，依次加入2.5mL去离子水和0.5mL 0.1％的三氯化铁溶液，反应10min后在700nm处测吸光值(吸光值越大，还原力越强)。以去离子水为阳性对照。实验重复三次，求平均值。
实施例1：蛋清蛋白-儿茶素自由基接枝物的制备
在蛋清中加入9倍体积的水稀释，最终蛋白质量分数为1％，调节pH至5.0左右，搅拌10-20min，自然沉淀1h，然后过滤去除不溶的蛋白成分。取50mL蛋清溶液于100mL三角瓶中，加入1.0mL 5M过氧化氢和0.25g抗坏血酸，搅拌均匀后置于室温下2h，再加入0.025g儿茶素，25℃条件下反应24h，再对样品进行透析48h，每隔6h换水一次以确保未反应的游离多酚完全透析出去，最后冷冻干燥后得到样品。
实施例2：蛋清蛋白-儿茶素自由基接枝物的制备
在蛋清中加入9倍体积的水稀释，最终蛋白质量分数为1％，调节pH至5.0左右，搅拌10-20min，自然沉淀1h，然后过滤去除不溶的蛋白成分。取50mL蛋清溶液于100mL三角瓶中，加入0.5mL 5M过氧化氢和0.0625g抗坏血酸，搅拌均匀后置于室温下2h，再加入0.05g儿茶素，25℃条件下反应24h，再对样品进行透析48h，每隔6h换水一次以确保未反应的游离多酚完全透析出去，最后冷冻干燥后得到样品。
实施例3：蛋清蛋白-儿茶素自由基接枝物的制备
在蛋清中加入9倍体积的水稀释，最终蛋白质量分数为1％，调节pH至5.0左右，搅拌10-20min，自然沉淀1h，然后过滤去除不溶的蛋白成分。取50mL蛋清溶液于100mL三角瓶中，加入2.0mL 5M过氧化氢和0.5g抗坏血酸，搅拌均匀后置于室温下2h，再加入0.1g儿茶素，25℃条件下反应24h，再对样品进行透析48h，每隔6h换水一次以确保未反应的游离多酚完全透析出去，最后冷冻干燥后得到样品。
此外，发明人发现，当继续增大儿茶素与蛋白的比例，会导致体系中出现大量沉淀，反应无法继续进行。发明人也尝试了使用卵白蛋白作为主要原料，发现卵白蛋白含量为1％时，在100ml溶液中，过氧化氢添加量超过1mmol或者抗坏血酸添加量超过0.04g时，卵白蛋白将变性沉淀，影响反应的进行。因此，卵白蛋白不适合作为蛋白-多酚自由基接枝物的主要原料。
对照例1：蛋清蛋白空白样的制备
在蛋清中加入9倍体积的水稀释，最终蛋白质量分数为1％，调节pH至5.0左右，搅拌10-20min，自然沉淀1h，然后过滤去除不溶的蛋白成分。取50mL蛋清溶液于100mL三角瓶中，25℃条件下反应24h，再对样品进行透析48h，每隔6h换水一次，最后冷冻干燥后得到样品。
对照例2：蛋清蛋白对照样的制备
在蛋清中加入9倍体积的水稀释，最终蛋白质量分数为1％，调节pH至5.0左右，搅拌10-20min，自然沉淀1h，然后过滤去除不溶的蛋白成分。取50mL蛋清溶液于100mL三角瓶中，加入1.0mL 5M过氧化氢和0.25g抗坏血酸，搅拌均匀后置于室温下2h，再置于25℃条件下反应24h，再对样品进行透析48h，每隔6h换水一次，最后冷冻干燥后得到样品。
对照例3：蛋清蛋白-儿茶素碱法复合物的制备
在蛋清中加入9倍体积的水稀释，最终蛋白质量分数为1％，调节pH至5.0左右，搅拌10-20min，自然沉淀1h，然后过滤去除不溶的蛋白成分。取50mL蛋清溶液于100mL三角瓶中，调节pH至10.0，加入0.025g儿茶素，25℃条件下反应24h，再对样品进行透析48h，每隔6h换水一次以确保未反应的游离多酚完全透析出去，最后冷冻干燥后得到样品。
对照例4：蛋清蛋白-儿茶素碱法复合物的制备
在蛋清中加入9倍体积的水稀释，最终蛋白质量分数为1％，调节pH至5.0左右，搅拌10-20min，自然沉淀1h，然后过滤去除不溶的蛋白成分。取50mL蛋清溶液于100mL三角瓶中，调节pH至10.0，加入0.05g儿茶素，25℃条件下反应24h，再对样品进行透析48h，每隔6h换水一次以确保未反应的游离多酚完全透析出去，最后冷冻干燥后得到样品。
对照例5：蛋清蛋白-儿茶素碱法复合物的制备
在蛋清中加入9倍体积的水稀释，最终蛋白质量分数为1％，调节pH至5.0左右，搅拌10-20min，自然沉淀1h，然后过滤去除不溶的蛋白成分。取50mL蛋清溶液于100mL三角瓶中，调节pH至10.0，加入0.1g儿茶素，25℃条件下反应24h，再对样品进行透析48h，每隔6h换水一次以确保未反应的游离多酚完全透析出去，最后冷冻干燥后得到样品。
对照例6：明胶空白样的制备
配制1％明胶溶液于45℃热水中，充分搅拌至明胶完全溶解。取50mL明胶溶液于100mL三角瓶中，25℃条件下反应24h，再对样品进行透析48h，每隔6h换水一次，最后冷冻干燥后得到样品。
对照例7：明胶-儿茶素自由基接枝物的制备
配制1％明胶溶液于45℃热水中，充分搅拌至明胶完全溶解。取50mL明胶溶液于100mL三角瓶中，加入0.5mL 5M过氧化氢和0.0625g抗坏血酸，搅拌均匀后置于室温下2h，再加入0.05g儿茶素，25℃条件下反应24h，再对样品进行透析48h，每隔6h换水一次以确保未反应的游离多酚完全透析出去，最后冷冻干燥后得到样品。
对照例8：明胶-儿茶素自由基接枝物的制备
配制1％明胶溶液于45℃热水中，充分搅拌至明胶完全溶解。取50mL明胶溶液于100mL三角瓶中，加入2.0mL 5M过氧化氢和0.5g抗坏血酸，搅拌均匀后置于室温下2h，再加入0.1g儿茶素，25℃条件下反应24h，再对样品进行透析48h，每隔6h换水一次以确保未反应的游离多酚完全透析出去，最后冷冻干燥后得到样品。
此外，发明人还发现，明胶作为主要原料时，当明胶含量高于1％时，体系温度为室温时，在反应过程中明胶将形成凝胶，影响反应的进行。因此，明胶的含量需要控制在1％及以下。
检测了按照实施例1-3以及对照例1-8的方法得到的样品的抗氧化性，结果如表1所示。
表1样品的抗氧化性
DPPH法、ABTS法和铁还原力法常用于抗氧化成分的体外抗氧化性评价，DPPH和ABTS自由基清除率越高，铁还原力的吸光值越高，表示样品的抗氧化性越强。由表1可知，按照本发明的方法制备的蛋清蛋白-儿茶素自由基接枝物，蛋清蛋白与过氧化氢、抗坏血酸、儿茶素之间协同作用，具有更强的抗氧化性，明显优于对照组。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。