细胞凋亡抑制剂及其用途的制作方法

相关申请

本专利申请要求2010年11月18日提交的国际专利申请号PCT/IB2010/003158的优先权，其通过引用以其整体并入本文。

发明领域

本发明涉及细胞凋亡抑制剂和它们的用途，特别是在医疗中的用途。

发明背景

冠心病是全世界范围内主要的死亡原因，造成每年报道380万男性死亡和340万女性死亡。随着人口老化和并发症(例如，肥胖症和代谢综合症)变得更加普遍，如在近些年中，由缺血性心脏疾病引起的巨大的公共健康负担甚至可能进一步增加(在Yellon等，N Engl J Med，2007；357：1121-1135中综述)。

冠心病是指冠脉循环不能为心肌和周围组织提供充足的血液供应。冠心病最常见的原因是冠状动脉壁内动脉粥样斑块(即，脂肪沉积物)的聚集。冠状动脉的阻塞限制血液流入心脏，导致心肌细胞的缺血(即，缺氧继发的细胞饥饿)并且可能导致心肌细胞死亡，其被称为心肌梗死(MI)或急性心肌梗死(AMI)-通常被称为心脏病发作。AMI在欧洲和美国都是主要的死亡原因，并且仍然为常见的(在美国每年多于150万新病例)和致残(导致心脏衰竭)的疾病。梗塞面积是AMI后心肌功能恢复和死亡的主要决定因素。目前，限制梗塞面积的最有效的方式是通过使用冠状动脉的血管成形术或溶栓方法尽快再灌注受损的心肌并且使用抗血小板治疗预防冠状动脉的再阻塞。再灌注，或向缺血心肌恢复血流，通过溶解血栓的溶栓治疗或通过经皮的冠状动脉血管成形术扩张阻塞的动脉来实现。通常，再灌注对于挽救心肌细胞和心脏功能是必需的。然而，再灌注启动了导致“再灌注损伤”的事件级联。这也在搭桥手术期间心脏的心脏停搏恢复后发生。再灌注损伤的特征为心律失常、导致无复流现象的内皮功能障碍和心肌顿抑(心肌收缩的可逆性丧失)。

再灌注损伤最终导致在就在心肌再灌注之前存活的心肌细胞的凋亡性死亡。在心肌缺血/再灌注期间涉及高度调节形式的细胞死亡可导致在再灌注阶段中新的治疗干预。然而，在心肌缺血/再灌注期间涉及的体内细胞凋亡信号传导途径还未完全被阐明。

因此，寻找用于抑制细胞凋亡(即，“程序细胞死亡”)，特别是用于治疗心肌梗死和再灌注损伤的新的治疗构成了保护心脏功能并且拯救生命的现实挑战。

发明概述

本发明基于以下发现：有可能通过抑制Fas信号传导途径在心肌梗死之后减少心肌细胞的凋亡。Fas受体在结合FasL(Fas配体)后三聚化并通过称作DD(死亡结构域(Death Domain))的胞质结构域诱导细胞凋亡，所述胞质结构域与信号传导衔接蛋白例如FAF-1(Fas相关因子-1)、FADD(Fas相关死亡结构域)、DAXX(死亡结构域相关蛋白)、FAP-1、FLASH(FLICE相关巨蛋白)和RIP(受体相互作用蛋白)相互作用。DAXX和FADD独立地结合Fas，并激活明显不同的细胞凋亡途径。DAXX可通过激活JNK激酶级联来增强Fas介导的细胞凋亡，从而最终完成转录因子例如c-Jun的磷酸化和激活。相反，通过信号传导半胱天冬酶的级联，FADD引发线粒体促凋亡因子如CytoC(细胞色素-C)和SMAC(第二线粒体源的半胱天冬酶激活剂(second mitochondria-derivedactivator of caspase)(也称作Diablo)的释放。

发明人已表明抑制Fas受体与DAXX(SEQ ID NO：1)或与FADD(SEQ ID NO：8)的相互作用导致心肌梗死之后心肌细胞的细胞凋亡的强烈减少。此外，本发明人已出乎意料地发现DAXX和FADD的小片段分别保留了完整蛋白DAXX和FADD的抗凋亡能力。

因此，本发明涉及一种由以下片段组成的肽：

-SEQ ID NO：1的DAXX蛋白的16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续氨基酸残基的片段，其中所述片段包含SEQ IDNO：5所示的氨基酸序列，或

-SEQ ID NO：8的FADD蛋白的9、10、11、12、13、14、15、16或17个连续氨基酸残基的片段，其中所述片段包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，

其中所述肽能够抑制细胞凋亡。

在某些实施方案中，根据本发明的抗凋亡肽为由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的DAXX蛋白片段。在其它实施方案中，抗凋亡肽为由SEQ ID NO：21-44任一所示的氨基酸序列组成的DAXX片段。

在其它实施方案中，根据本发明的抗凋亡肽为由SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列组成的FADD蛋白片段。在其它实施方案中，抗凋亡肽为由SEQ ID NO：45-57任一所示的氨基酸序列组成的FADD片段。

在另一方面，本发明涉及一种根据本发明的抗凋亡肽的拟肽。

在又一方面，本发明提供一种包含与细胞穿膜肽连接的本发明的抗凋亡肽或拟肽的偶联物。细胞穿膜肽可以为Tat、RXR、Bpep或Pip2b。

在某些实施方案中，细胞穿膜肽通过接头连接至肽或拟肽上。

在某些实施方案中，细胞穿膜肽选自Tat、RXR、Bpep和Pip2b。

特别地，在某些优选的实施方案中，偶联物由SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列组成。

在又一方面，本发明涉及一种包含至少一种药学上可接受的载体或赋形剂和有效量的根据本发明的至少一种肽或至少一种拟肽或至少一种偶联物的药物组合物。

在某些实施方案中，根据本发明的药物组合物进一步包含至少一种另外的生物活性剂。特别地，所述生物活性剂可选自环孢霉素A、BH4及其组合。

在再另一方面，本发明提供用于治疗人或动物体的方法中，特别是用于抑制人或动物体中细胞凋亡的方法中的根据本发明的肽、拟肽、偶联物和药物组合物。

在某些实施方案中，根据本发明的肽、拟肽、偶联物和药物组合物用于治疗人或动物体的急性心肌梗死(AMI)、脑梗塞、器官移植、心脏介入术(体外循环和临时血管阻塞)或急性循环扰动(休克状态)的方法。

在其它实施方案中，根据本发明的肽、拟肽、偶联物和药物组合物用于治疗人或动物体的局部缺血，特别是心肌缺血、肾脏缺血、缺血性结肠炎、肠系膜缺血、脑缺血、肢体缺血或皮肤缺血的方法中。

在再其它的实施方案中，根据本发明的肽、拟肽、偶联物和药物组合物用于治疗人或动物体的再灌注损伤的方法中。

在相关的方面，本发明也提供一种用于治疗与受试者的细胞凋亡相关的疾病或病症的方法，包括步骤：向所述受试者施用有效量的根据本发明的至少一种肽、或至少一种拟肽、或至少一种偶联物或至少一种药物组合物。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者施用至少一种选自环孢霉素A、BH4及其组合的另外的生物活性剂的步骤。

如上所述，在这些治疗方法中，与细胞凋亡相关的疾病或病症可选自急性心肌梗死(AMI)、脑梗塞、器官移植、心脏介入术、急性循环扰动、再灌注损伤和局部缺血。

第1项.一种由以下组成的肽：

-SEQ ID NO：1的DAXX蛋白质的16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续氨基酸残基的片段，其中所述片段包含SEQID NO：5所示的氨基酸序列，或

-SEQ ID NO：8的FADD蛋白质的9、10、11、12、13、14、15、16或17个连续氨基酸残基的片段，其中所述片段包含SEQ IDNO：12所示的氨基酸序列，

其中所述肽能够抑制细胞凋亡。

第2项.根据第1项的肽，其中所述肽是DAXX蛋白质片段，并且由SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：17-44中任一所示的氨基酸序列组成。

第3项.根据第1项的肽，其中所述肽是FADD蛋白质片段，并且由SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：45-57中任一所示的氨基酸序列组成。

第4项.一种第1-3项任一项的肽的拟肽。

第5项.一种包含与细胞穿膜肽连接的根据第1-3项任一项的肽或根据第4项的拟肽的偶联物。

第6项.根据第5项的偶联物，其中所述肽或所述拟肽类通过接头与细胞穿膜肽连接。

第7项.根据第5项或第6项的偶联物，其中所述细胞穿膜肽选自Tat、RXR、Bpep和Pip2b。

第8项.根据第7项的偶联物，其中所述偶联物由SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60或SEQ IQ NO：61所示的氨基酸序列组成。

第9项.一种药物组合物，包含有效量的至少一种根据第1-3项任一项的肽或至少一种根据第4项的拟肽或至少一种根据第5-8项任一项的偶联物，和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。

第10项.第9项的药物组合物，进一步包含至少一种另外的生物活性剂。

第11项.根据第10项的药物组合物，其中所述至少一种另外的生物活性剂选自环孢霉素A、BH4及其组合。

第12项.根据第1-3项任一项的肽、或根据第4项的拟肽、根据第5-8项任一项的偶联物或第8-10项任一项的药物组合物，用于治疗人或动物体的方法中。

第13项.根据第1-3项任一项的肽、或根据第4项的拟肽、根据第5-8项任一项的偶联物或第8-10项任一项的药物组合物，用于抑制人或动物体中的细胞凋亡的方法中。

第14项.根据第1-3项任一项的肽、或根据第4项的拟肽、根据第5-8项任一项的偶联物或第9-11项任一项的药物组合物，用于治疗人或动物体的急性心肌梗死(AMI)、脑梗塞、器官移植、心脏介入术(体外循环和临时血管闭塞)或急性循环扰动(休克状态)的方法中。

第15项.根据第1-3项任一项的肽、或根据第4项的拟肽、根据第5-8项任一项的偶联物或第9-11项任一项的药物组合物，用于治疗人或动物体的局部缺血，特别是心肌缺血、肾脏缺血、缺血性结肠炎、肠系膜缺血、脑缺血、肢体缺血或皮肤缺血的方法中。

第16项.根据第1-3项任一项的肽、或根据第4项的拟肽、根据第5-8项任一项的偶联物或第9-11项任一项的药物组合物，用于治疗人或动物体的再灌注损伤的方法中。

第17项.根据第12-16项任一项的肽、其衍生物、其偶联物或其药物组合物，其中所述方法还包括向所述人或动物体施用环孢霉素A和/或BH4的步骤。

第18项.一种治疗受试者中与细胞凋亡相关的疾病或病症的方法，包括步骤：

-向所述受试者施用有效量的至少一种根据第1-3项任一项的肽、或根据第4项的拟肽、或根据第5-8项任一项的偶联物或根据第9-11项任一项的药物组合物。

第19项.根据第18项的方法，进一步包括步骤：向所述受试者施用至少一种选自环孢霉素A、BH4及其组合的另外的生物活性剂。

第20项.根据第18或19项的方法，其中所述与细胞凋亡相关的疾病或病症选自急性心肌梗死(AMI)、脑梗塞、器官移植、心脏介入术、急性循环扰动、再灌注损伤和局部缺血。

本发明的这些和其它目的、优点和特征对于已阅读了以下优选实施方案的详述的本领域技术人员而言将变得显而易见。

附图简要说明

图1：通过SPOT合成确定DAXX表位。(A)将DAXX的氨基酸序列分割成重叠肽阵列(肽扫描(pepscan)；具有三个氨基酸位移的15聚体肽)并且在酶联印迹中分析。黑色长方形显示四个最亮的点并示出了相应的表位序列。温育条件：Fas受体的His-标记的细胞内区域[10μg/ml]；抗体：抗-His-(小鼠)(Sigma H1029；1∶6,000)/抗-小鼠-HRP(Calbiochem 401207；1∶2,000)，暴露时间：1分钟。(B)包含16-merKKSRKEKKQTGSGPLG的人DAXX序列(＝SEQ ID NO：5的DAXXp)与其它物种(小鼠、大鼠、狗(CANFA)和绿猴(CHLAE))的DAXX序列的比对。

图2：通过SPOT合成确定DAXX表位(＝DAXXp)的最佳长度。(A)(分别为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的)DAXXp-211和DAXXp-209肽在N-端、C-端和在N-和C-端两者连续缩短一个氨基酸残基并且使用酶联印迹进行分析。由箭头指示的点表现出最高的信号强度(BLU)。温育条件：Fas受体的His-标记的细胞内区域[10μg/ml]；抗体：抗-His-(小鼠)(Sigma H1029；1∶6,000)/抗-小鼠-HRP(Calbiochem 401207；1∶2,000)，暴露时间：1分钟。(B)肽序列DAXXp-211和DAXXp-209的比对；对应于最亮的点，以确定最佳DAXX肽序列。

图3：Tat-DAXXp和Pip2b-DAXXp蛋白酶能力的评价。Tat-DAXXp和Pip2b-DAXXp偶联物(A)在胎牛血清(FBS，BioWest)中和(B)在新鲜制备的小鼠血清(MS)中的稳定性测量。将肽与20％的血清在37℃下温育0h、1h、2h、4h、8h、24h和48h，并且将50μl的温育混合物在100μl的在H₂O/CH₃CN(50/50)中的10％二氯乙酸(DCA)中沉淀。将样品混合并且保持在-20℃下。通过离心(14000rpm，10分钟)分离沉淀的血清蛋白并且通过反相HPLC分析上清液(以mV*sec测量峰面积)。对于每一条件n≥2。在小鼠血清中2h温育之后，超过70％的肽仍然完整，而在24小时后，所有的肽被降解。

图4：细胞分布取决于温育时间。将原代心肌细胞与CF-标记的Tat-DAXXp偶联物(绿色荧光)的1μM溶液一起温育1h、4h或6h。用Hoechst染料(蓝)将细胞核染色。白色的条表示10μm。在温育1h后CF-Tat-DAXXp的细胞内分布显示细胞溶质中的斑点图案(其为肽通过内吞作用内在之后的内涵体包裹(endosomal entrapment)特征)且未检测到核定位。温育4h后，CF-Tat-DAXXp似乎能够逸出内涵体囊泡，从而产生更扩散性的标记图案。此外，观察到核积聚。在更长的温育时间(6小时)后，CF-标记的肽被包封在大囊泡(白色箭头)中并且从细胞中消除。

图5：CPPs和CPP-偶联物抗凋亡活性的体外评价。在(A)C2C12细胞、(B)原代心肌细胞、(C)H9c2细胞和(D)NG108-15细胞中DNA片段化的工作流程和量化。将数据针对100％STS标准化。显示的数据为平均值±SEM，其中n≥5。将细胞接种在24孔板上并且生长过夜。第二天，将细胞与单独的STS或与STS+1μM肽一起温育培养(在OptiMEM中)(对于各种细胞的STS浓度和温育时间在图中给出)。其后，将溶液移除，用完全培养基替代并且再温育40h。再生期之后，将细胞裂解并且根据制造商的说明检测DNA片段化(细胞死亡检测ELISA^PLUS试剂盒-Roche Diagnostics)。

图6：Tat-DAXXp序列变体在原代心肌细胞上的抗凋亡活性。如在图5的说明中描述的，评价DAXXp序列的不同类似物(参见表2)对于STS的抗凋亡性能(细胞死亡检测ELISA^PLUS试剂盒-Roche Diagnostics)。没有一种类似物能够保护原代心肌细胞-确认16聚体DAXXp具有对于最高心脏保护作用的最佳长度和序列的事实。

图7：就C2C12细胞、原代心肌细胞和H9c2上的抗凋亡活性而言，鼠/大鼠DAXXp和人DAXXp序列的比较。就针对STS的抗凋亡性能而言(细胞死亡检测ELISA^PLUS试剂盒-Roche Diagnostics)，将连接到Tat上的鼠DAXXp序列(Tat-mDAXXp-SEQ ID NO：61)(其与大鼠DAXXp序列相同(参见图1B))与人构建体(Tat-DAXXp)相比较。使用的C2C12细胞和原代心肌细胞来自小鼠，H9c2细胞来自大鼠。在所有的细胞中，由于鼠或大鼠的细胞类型，使用鼠Tat-mDAXXp序列观察到抗凋亡效应的提高。

图8：FADDp15的测定及其在心肌细胞中抗凋亡作用。(A)将FADD的蛋白序列分割成重叠肽阵列(肽扫描；具有三个氨基酸位移的15聚体肽)并且使用酶联印迹进行分析。黑色长方形显示三个最亮的点和示出相应的表位序列，下方提供点编号和信号强度(BLU)。(B)FADDp-11的肽序列(＝FADDp15＝SEQ ID NO：9)在C-端、N-端或在C-和N-端两者连续缩短一个氨基酸残基并且使用酶联印迹进行分析。由箭头指示的点表现最高信号强度(BLU)。最短的FADD表位(具有序列KRKLERVQS(＝FADDp＝SEQ ID NO：12)的9聚体)对应于点No.24。温育条件：Fas受体的His-标记的细胞内区域[10μg/ml]；抗体：抗-His-(小鼠)(Sigma H1029；1∶6,000)/抗-小鼠-HRP(Calbiochem 401207；1∶2,000)，暴露时间：1分钟。

图9：就原代心肌细胞和H9c2细胞中的抗凋亡活性而言，FADDp构建体与Tat-DAXXp的比较。在(A)原代心肌细胞和在(B)H9c2细胞中DNA片段化的量化。将数据针对100％STS标准化。显示的数据为平均值±SEM，其中n≥5。将细胞接种在24孔板上并且生长过夜。第二天，将细胞与单独的STS或与STS+1μM肽一起温育(在OptiMEM中)(在图中给出了STS浓度和在图5中给出了温育时间)。其后，将溶液移除，用完全培养基替代并且再温育40h。再生期之后，将细胞裂解并且根据制造商的说明检测DNA片段化(细胞死亡检测ELISA^PLUS试剂盒-Roche Diagnostics)。据发现短的Tat-FADDp序列的有效性低于Tat-DAXXp，但是较长Tat-FADDp15具有相同的(在H9c2中)或提高的(在原代心肌细胞中)抗凋亡效应。

图10：在原代心肌细胞和在H9c2细胞中Tat-DAXXp和Tat-FADDp15单独和组合的比较。当与1μM单独的肽相比时，发现与0.5μM Tat-DAXXp和0.5μM Tat-FADDp15二者的温育导致相同或甚至更高的抗凋亡作用。此外，与1μM的两种肽一起温育导致在两种细胞类型中最高的保护，表明Tat-DAXXp和Tat-FADDp15的组合可能是有希望的应用。

图11：体内实验方案。使C57B16小鼠经受心肌缺血-再灌注(IR)手术方案。黑框表示小鼠接受的缺血时间。梗死面积或细胞死亡测量在各方案的手术结束时(用↑指示)进行。IR_60’：40分钟的缺血，60分钟的再灌注。IR_24h：40分钟的缺血和24小时的再灌注。

图12：Tat-DAXXp(1mg/kg-IV)在经受IR_60’的小鼠中的心脏保护作用。梗死面积(处于危险中的面积的％)和由ELISA测定的核小体间DNA片段化在经受IR_60’并用Tat、Tat-DAXXp或Tat-scrDAXXp(1mg/kg)以及用DAXXp(10mg/kg)处理(在再灌注前5分钟静脉注射(IV))的小鼠中量化。以平均值±SEM作图：(A)：处于危险中的面积/LV质量(左心室)，(B)：梗死面积(处于危险中的面积的％)和(C)：(I/NI比率)，其对应于LV组织的缺血部分对非缺血部分中可溶性核小体的比率。使用单因素ANOVA分析通过用于多重比较的Neuman-Keuls事后检验进行统计学分析(GraphPad Prism软件)。相对于Tat-DAXXp的P＜0.05，P＜0.01和P＜0.001分别标记为*、**和***。对于P＞0.05，P＝ns(不显著)。

图13：在经受IR_60’的小鼠中对于Tat-DAXXp和DAXXp的剂量响应。梗死面积(处于危险中的面积的％)和通过ELISA测定的核小体间DNA片段化在经受IR_60’并在再灌注之前5分钟用静脉注射Tat(1mg/kg)、Tat-DAXXp(0.1、1和10mg/kg)或DAXXp(0.1、1和10mg/kg)处理的小鼠中量化。以平均值±SEM作图：(A)：处于危险中的面积/LV质量(左心室)，(B)：梗死面积(处于危险中的面积的％)和(C)：(I/NI比率)，其对应于在LV组织的缺血部分对非缺血部分中可溶性核小体的比率。

图14：Tat-DAXXp(1mg/kg-IV)在经受IR_24h的小鼠中的心脏保护作用。梗死面积(处于危险中的面积的％)和由ELISA测定的核小体间DNA片段化在经受IR_24H并用Tat、Tat-DAXXp或Tat-scrDAXXp(1mg/kg)以及用DAXXp(10mg/kg)处理(在再灌注前5分钟静脉注射(IV))的小鼠中量化。以平均值±SEM作图：(A)：处于危险中的面积/LV质量(左心室)，(B)：梗死面积(处于危险中的面积的％)和(C)：(I/NI比率)，对应于在LV组织的缺血部分对非缺血部分中可溶性核小体的比率。使用单因素ANOVA分析通过用于多重比较的Neuman-Keuls事后检验进行统计学分析(GraphPad Prism软件)。相对于Tat-DAXXp的P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001分别标记为*、**和***。对于P＞0.05，P＝ns(不显著)。

图15：在经受IR_24h的小鼠中对于Tat-DAXXp和DAXXp的剂量响应。在经受IR_24h并通过在再灌注之前5分钟静脉注射Tat(1mg/kg)、Tat-DAXXp(0.1、1和10mg/kg)或DAXXp(0.1、1和10mg/kg)处理的小鼠中测定处于危险中的面积和梗死面积(处于危险中的面积的％)。以平均值±SEM作图：(A)：处于危险中的面积/LV质量(左心室)，(B)：梗死面积(处于危险中的面积的％)。

图16：Tat-DAXXp构建体在心肌中的可视化。在再灌注时用1mg/kg CF-Tat-DAXXp构建体(CF：羧基荧光素)注射小鼠。在2小时的多聚甲醛固定之后(在磷酸盐缓冲液中的4％PFA)用振动切片机获得LV切片(20μm)。2μm共焦图像清楚地显示肌细胞中的绿色标记，表明在细胞溶质中肽构建体的存在。圆圈突出显示如在少数情况中观察到的肽构建体在DAPI-阳性核中的存在(油浸X40)。

图17：在肾脏移植期间冷缺血/再灌注损伤的初步数据。脑死亡和延长的冷缺血导致来自死亡供体肾脏移植体的较差长期移植结果的主要因素，而如果使用了扩展标准供体(‘边缘器官’)，甚至影响更大。靶向缺血-再灌注(IR)损伤相关的移植体内(intragraft)炎症对于改善这些移植的结果是引人注目的理念。(A)在大鼠肾脏移植期间冷缺血/再灌注的工作流程。在24h冷缺血之后，使用标准显微外科技术将肾脏移植体同位移植到雄性LEW受体中。在再灌注之后立即将肽以1mg/kg的单一i.v注射来注射。移植三天后，收获移植体进行RT-PCR分析(n＝3)。(B)将总RNA反转录成cDNA并且利用GeneAmp 5700序列检测系统(Applied Biosystems，Weiterstadt，德国)进行定量实时RT-PCR。ICAM-1、IFN-γ、TNF-α、白细胞介素(IL)-6和bcl-2(由Metabion，Martinsried，德国合成)的Taqman-PCR反应在25μl的最终体积中进行。这些初步数据显示在Tat-DAXXp的存在下，IFN-γ和ICAM-1的mRNA表达降低在移植三天后的肾脏移植体中发生。

定义

在整个说明书中，采用在以下段落中定义的几个术语。

术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，是指以其中性(不带电荷)形式或作为盐的形式、未修饰的或通过糖基化、侧链氧化或磷酸化修饰的多种长度的氨基酸序列。在某些实施方案中，氨基酸序列为全长天然蛋白质。然而，在优选实施方案中，氨基酸序列为全长蛋白质的片段。在再其它的实施方案中，氨基酸序列通过连接于氨基酸侧链的另外的取代基，例如糖基单元、脂质或无机离子(例如磷酸根)以及与链的化学转化(例如巯基的氧化)相关的修饰来进行修饰。因此，术语“蛋白质”(或其等价术语)意欲包括全长天然蛋白质、或其片段的氨基酸序列，其发生那些不显著改变其特定性质的修饰。特别地，术语“蛋白质”包括蛋白质异形体，即由相同基因编码但其pI或MW或二者均不同的变体。这种异形体的氨基酸序列可以不同(例如作为选择性剪接或限制性蛋白水解的结果)，或者这些异形体可由差异的翻译后修饰(例如，糖基化、酰基化、磷酸化)产生。

当在本文中用于指蛋白质或多肽时，术语“类似物”是指具有与该蛋白质或多肽相似或相同的功能但不是必定包含与该蛋白质或多肽的氨基酸序列相似或相同的氨基酸序列或者不是必定包含与该蛋白质或多肽的结构相似或相同的结构的肽。优选地，在本发明的情况中，类似物具有与该蛋白质或多肽的氨基酸序列至少30％相同，更优选地，至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中，蛋白质类似物具有与该蛋白质的氨基酸序列至少80％相同或至少85％相同，优选至少90％相同，和最优选至少95％相同的氨基酸序列。

当在本文中涉及蛋白质或多肽而使用时，术语“片段”是指包含该蛋白质或多肽的至少5个连续的氨基酸残基和少于30个连续的氨基酸残基的氨基酸序列的肽，例如该蛋白质或多肽的7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个连续的氨基酸残基，优选该蛋白质或多肽的9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个连续的氨基酸残基，和更优选该蛋白质或多肽的9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个连续的氨基酸残基。在本发明的情况中，蛋白质或多肽的片段保留全长蛋白质或多肽的功能活性。

如本文所用，术语“同源的(homologous)”(或“同源性(homology)”)与术语“同一性(identity)”同义，是指两个多肽分子间的序列相似性。当在两个对比的序列中的位置被相同氨基酸残基占据时，则相应分子在该位置处是同源的。如本文所用，序列同一性百分比是指氨基酸序列间的比较，并通过在比较窗口内比较两个最佳对准的序列来确定，其中与基准序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口中的氨基酸序列部分可包含添加或缺失(即，空位)以获得两个序列的最佳对准。百分比可通过以下方法计算：确定在两个序列中出现相同的氨基酸残基的位置数以得到匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗口中总位置数并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。或者，百分比可通过以下方法计算：确定在两个序列中出现相同的氨基酸残基的位置数或氨基酸残基与空位对准的位置数以得到匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗口中总位置数并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。本领域技术人员了解存在着许多已建立的算法可用于比对两个序列。用于比较的序列最佳比对可例如，使用Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch，1970，J.MoI.Biol.48：443的同源性比对算法、使用Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.ScL USA 85∶2444的相似性检索方法，利用这些运算法则的计算机执行程序(GCG Wisconsin Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或使用目视检查(通常参见，Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等编辑，Current Protocols，a joint venture between Greene PublishingAssociates，Inc.和John Wiley&Sons，Inc.，(1995增刊)(Ausubel))来进行。适于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的实例为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等，1990，J.MoI.Biol.215：403-410和Altschul等，1977，Nucleic Acids Res.3389-3402中。

同源的氨基酸序列共有相同或类似的氨基酸序列。在本发明的情况中，相似的残基是基准序列中相应氨基酸残基的保守置换或基准序列中相应氨基酸残基的“允许的点突变”。基准序列中残基的“保守置换”是与相应基准残基在物理上或功能上相似的置换，例如，具有相似尺寸、形状、电荷、化学性质包括形成共价键或氢键的能力，等。特别优选的保守置换为满足Dayhoff等为“可接受的点突变”所定义的标准的那些(“Atlas of Protein Sequence and Structure”，1978，Nat.Biomed.Res.Foundation，Washington，DC，Suppl.3，22：354-352)。

在本发明的情况中，术语“治疗”用以表征目的在于延迟或预防疾病或病症的发作、减缓或停止病症症状的进展、加重或恶化、改善病症症状和/或治愈病症的方法。治疗可在疾病或病症发作之前施用以用于预防性或防止作用。替代地或额外地，其可在疾病或病症开始之后施用以用于治疗作用。

如本文所用，术语“受试者”指人或动物，特别是哺乳动物(例如，灵长类动物、狗、猫、山羊、马、猪、小鼠、大鼠、兔等)，其可受与细胞凋亡相关的疾病或病症所影响，但可以患有或未患有该疾病或病症。在本发明的许多实施方案中，受试者为人类。在这样的实施方案中，受试者经常称为“个体”。术语“个体”不指定特定年龄，并因此包括儿童、青少年和成人。

本文将“药物组合物”定义为包含有效量的本发明的肽，和至少一种药学上可接受载体或赋形剂。

如本文所用，术语“有效量”是指足以实现其预期目标，例如，细胞、组织、系统或受试者中所需的生物或医学反应的肽、化合物、试剂、或组合物的任何量。例如，在本发明的某些实施方案中，该目标可为：抑制、预防或减少细胞凋亡，例如与再灌注损伤或器官移植相关的细胞凋亡；和/或预防或治疗与细胞凋亡相关的疾病或病症。

术语“药学上可接受载体或赋形剂”是指不干扰活性成分的生物活性的效力并在其施用的浓度下对主体不具有明显毒性的载体介质。该术语包括溶剂、分散体、介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。将这种介质和试剂用于药学活性物质是本领域所熟知的(参见例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，E.W.Martin，第18版，1990，Mack Publishing Co.：Easton，PA，其通过引用以其整体并入本文)。

优选实施方案的详述

如上所述，本发明涉及具有抗凋亡性质的肽，其可用作治疗和/或预防与细胞凋亡相关的大量疾病或病症的治疗剂。

抑制细胞凋亡的肽

本发明的肽包括具有抗凋亡活性的DAXX片段和FADD片段。

术语“DAXX”和“DAXX蛋白质”在本文中可互换使用。它们是指称为死亡相关蛋白质6的蛋白质，所述死亡相关蛋白质6在人中通过位于染色体6的短臂(p)上的21.3位处的DAXX基因(RefSeq(mRNA)：NM_001141969.1)编码。在优选实施方案中，DAXX具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。然而，DAXX蛋白质可为SEQ ID NO：1的DAXX蛋白质的异形体并因此可具有由人DAXX基因编码的任何氨基酸序列。

术语“FADD”和“FADD蛋白质”在本文中可互换使用。它们是指称为具有死亡结构域的Fas相关蛋白质的蛋白质，所述Fas相关蛋白质在人中由位于染色体11的长臂(q)上的13.3位处的FADD基因(RefSeq(mRNA)：NM_003824.3)编码。在优选实施方案中，FADD具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。然而，FADD蛋白质可为SEQ ID NO：8的FADD蛋白质的异形体并因此可具有由人FADD基因编码的任何氨基酸序列。

发明人已表明，由SEQ ID NO：5(“DAXXp”)、SEQ ID NO：6(“DAXXp-14”)或SEQ ID NO：2(“DAXXp-15”＝“DAXXp-211”)所示的氨基酸序列组成的肽(其全部为DAXX蛋白质(SEQ IDNO：1)的片段)与Fas受体相互作用，但仅DAXXp能够减少细胞凋亡。类似地，发明人已发现由SEQ ID NO：9(“FADDp15”)和SEQ ID NO：12(“FADDp”)所示的氨基酸序列组成的肽(其均为FADD蛋白质(SEQ ID NO：8)的片段)与Fas受体相互作用并减少细胞凋亡。

因此，在特定实施方案中，根据本发明的抗凋亡肽为由SEQ IDNO：5组成的16个连续氨基酸残基的DAXX片段。在另一个特定实施方案中，根据本发明的抗凋亡肽为包含SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个或24个连续氨基酸残基的DAXX片段。优选地，这种抗凋亡肽具有选自下组的氨基酸序列：

SEQ ID NO：17(KKSRKEKKQTGSGPLGN)，

SEQ ID NO：18(KKSRKEKKQTGSGPLGNS)，

SEQ ID NO：19(KKSRKEKKQTGSGPLGNSY)，

SEQ ID NO：20(KKSRKEKKQTGSGPLGNSYV)，

SEQ ID NO：21(CKKSRKEKKQTGSGPLG)，

SEQ ID NO：22(PCKKSRKEKKQTGSGPLG)，

SEQ ID NO：23(PPCKKSRKEKKQTGSGPLG)，

SEQ ID NO：24(GPPCKKSRKEKKQTGSGPLG)，

SEQ ID NO：25(SGPPCKKSRKEKKQTGSGPLG)，

SEQ ID NO：26(CKKSRKEKKQTGSGPLGN)，

SEQ ID NO：27(CKKSRKEKKQTGSGPLGNS)，

SEQ ID NO：28(CKKSRKEKKQTGSGPLGNSY)，

SEQ ID NO：29(CKKSRKEKKQTGSGPLGNSYV)，

SEQ ID NO：30(PCKKSRKEKKQTGSGPLGN)，

SEQ ID NO：31(PCKKSRKEKKQTGSGPLGNS)，

SEQ ID NO：32(PCKKSRKEKKQTGSGPLGNSY)，

SEQ ID NO：33(PCKKSRKEKKQTGSGPLGNSYV)，

SEQ ID NO：34(PPCKKSRKEKKQTGSGPLGN)，

SEQ ID NO：35(PPCKKSRKEKKQTGSGPLGNS)，

SEQ ID NO：36(PPCKKSRKEKKQTGSGPLGNSY)，

SEQ ID NO：37(PPCKKSRKEKKQTGSGPLGNSYV)，

SEQ ID NO：38(GPPCKKSRKEKKQTGSGPLGN)，

SEQ ID NO：39(GPPCKKSRKEKKQTGSGPLGNS)，

SEQ ID NO：40(GPPCKKSRKEKKQTGSGPLGNSY)，

SEQ ID NO：41(GPPCKKSRKEKKQTGSGPLGNSYV)，

SEQ ID NO：42(SGPPCKKSRKEKKQTGSGPLGN)，

SEQ ID NO：43(SGPPCKKSRKEKKQTGSGPLGNS)，和

SEQ ID NO：44(SGPPCKKSRKEKKQTGSGPLGNSY)。

在特定实施方案中，根据本发明的抗凋亡肽为由SEQ ID NO：12组成的9个连续氨基酸残基的FADD片段。在另一个特定实施方案中，根据本发明的抗凋亡肽为由SEQ ID NO：9组成的15个连续氨基酸残基的FADD片段。在再其它的特定实施方案中，根据本发明的抗凋亡肽为包含SEQ ID NO：12的9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个连续氨基酸残基的FADD片段。优选地，这种抗凋亡肽具有选自下组的氨基酸序列：

SEQ ID NO：45(KRKLERVQSG)，

SEQ ID NO：46(KRKLERVQSGL)，

SEQ ID NO：47(KRKLERVQSGLD)，

SEQ ID NO：48(KRKLERVQSGLDL)，

SEQ ID NO：49(RKRKLERVQS)，

SEQ ID NO：50KRKRKLERVQS)，

SEQ ID NO：51(GKRKLERVQSG)，

SEQ ID NO：52(GKRKLERVQSGL)，

SEQ ID NO：53(GKRKLERVQSGLD)，

SEQ ID NO：54(GKRKLERVQSGLDL)，

SEQ ID NO：55(VGKRKLERVQSG)，

SEQ ID NO：56(VGKRKLERVQSGL)，和

SEQ ID NO：57(VGKRKLERVQSGLD)。

如上所述，在某些实施方案中，DAXX蛋白质为SEQ ID NO：1的DAXX蛋白质的异形体。在这样的实施方案中，根据本发明的抗凋亡肽可以是与SEQ ID NO：1的DAXX蛋白质中SEQ ID NO：5的片段对应的16个连续氨基酸残基的DAXX片段。

类似地，如上所述，在某些实施方案中，FADD蛋白质为SEQ ID NO：8的FADD蛋白质的异形体。在这样的实施方案中，根据本发明的抗凋亡肽可以是与SEQ ID NO：8的FADD蛋白质中SEQ ID NO：12的片段对应的9个连续氨基酸残基的FADD片段；或可以是与SEQ ID NO：8的FADD蛋白质中SEQ ID NO：9的片段对应的15个连续的氨基酸残基的FADD片段。

DAXX异形体和FADD异形体优选具有分别与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：8的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的同一性，和更优选分别与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：8的至少95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的同一性的氨基酸序列。

根据本发明的肽以及其衍生物和偶联物(见下文)能够抑制、预防和/或减少细胞凋亡，特别是心肌细胞的细胞凋亡。这种能力可使用技术人员已知的任何适合方法来评价，例如使用细胞凋亡检测试剂盒。适用于测量细胞凋亡的试剂盒的实例为细胞死亡检测试剂盒(Cat.No.11 774 425 001，Roche Applied Science)。

根据本发明的肽的衍生物

本发明也涉及根据本发明的肽的生物活性衍生物。“生物活性衍生物”是指保留了本发明的肽抑制、预防或减少细胞凋亡的能力的本发明肽的任何衍生物。

在某些实施方案中，生物活性衍生物具有经过化学和/或生物修饰的本发明抗凋亡肽的氨基酸序列。

衍生物的实例为其中具有以下特征的根据本发明的肽：

-肽的至少一个氨基酸残基被置换或删除，

-至少一个另外的氨基酸残基被插入肽中，和/或

-肽的至少一个氨基酸残基被化学改变或衍生化。

优选地，根据本发明的生物活性衍生物包含选自置换、插入、缺失、改变或衍生化的仅一个或仅两个氨基酸残基修饰。在某些优选实施方案中，生物活性衍生物含有一个保守置换或两个保守置换。在某些优选实施方案中，根据本发明的DAXX片段的衍生物具有影响SEQ ID NO：5之外的氨基酸残基(即，其不包含于SEQ ID NO：5内)的一个或两个修饰；和根据本发明的FADD片段的衍生物具有影响SEQ ID NO：12之外的氨基酸残基(即，其不包含于SEQ ID NO：12内)的一个或两个修饰。

适合的“化学改变或衍生化的”氨基酸包括，例如，天然存在的氨基酸衍生物，例如对于脯氨酸的4-羟基脯氨酸、对于赖氨酸的5-羟基赖氨酸、对于丝氨酸的高丝氨酸、对于赖氨酸的鸟氨酸等。其它“化学改变或衍生化的”氨基酸包括连接于例如标记物(例如荧光素、四甲基若丹明或青色染料Cy5.5)的氨基酸；或带有一个或多个翻译后修饰(例如乙酰化、酰胺化、甲酰化、羟基化、甲基化、磷酸化、硫酸化、糖基化或脂化)的氨基酸残基。事实上，某些化学修饰，特别是N-端糖基化，已显示增强了肽在人血清中的稳定性(Powell等，Pharma Res 1993：10：1268-1273)。“化学改变或衍生化的”氨基酸也包括具有有通过N-肉豆蔻酰化获得的增强的膜渗透性的那些氨基酸(Brand等，Am J Physiol Cell Physiol 1996；270：C1362-C1369)。

根据本发明的肽的其它衍生物为所述肽的拟肽。拟肽是指具有根据本发明的肽的基本上相同的结构和/或功能特性的合成化合物。该模拟物(mimetic)可完全由合成的、非天然氨基酸类似物组成，或可以为包括一个或多个天然氨基酸和一个或多个非天然氨基酸类似物的嵌合分子。模拟物也可整合任何数目的不破坏模拟物活性的天然氨基酸保守置换。采用根据本发明的测试A，常规测试可用于测定模拟物是否具有所需的活性。当涉及模拟物或拟肽而使用时，短语“基本上相同”是指模拟物或拟肽具有所指分子的一种或多种活性或功能，特别是抑制细胞凋亡。用于开发拟肽的技术是常规的。例如，肽键可被非肽键或非天然氨基酸(其允许该拟肽采取与原始肽类似的结构并由此具有类似的生物活性)替代。也可通过用具有类似结构的其它化学基团替代氨基酸的化学基团来进行进一步的修饰。可通过NMR谱学、结晶学和/或计算机辅助分子建模确定原始片段/肽的三级结构来辅助拟肽的开发，所述初始片段/肽为游离的或者结合至Fas受体的细胞内区域上。一旦鉴定了潜在的拟肽化合物，则可将其合成并且可分析其抑制细胞凋亡的能力。

拟肽可含有非天然结构成分的任何组合，所述非天然结构成分通过来自三种结构基团：除天然胺键(“肽键”)连接之外的残基连接基团；代替天然存在的氨基酸残基的非天然残基；诱导二级结构拟态(例如，β转角、γ转角、β折叠、α螺旋构型)的残基；或赋予抗蛋白质水解抗性的其它改变。例如，赖氨酸模拟物可通过与丁二酸酐或其它羧酸酐的反应来产生。赖氨酸和其它含α-氨基的残基的模拟物也可通过与酰亚胺酯如甲基吡啶亚胺甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、硼氢化氯(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2，4-戊二酮的反应及与乙醛酸的转酰胺基酶-催化的反应来产生。

也可和具有相反手性的氨基酸(或拟肽残基)替代一个或多个残基。因此，可用相同但具有相反手性的氨基酸或模拟物(称为D-氨基酸，但其也可称为R-或S-型)替代任何天然以L-构型存在的氨基酸(取决于化学实体的结构，其也可称为R或S)。

如本领域技术人员所理解的，本发明的拟肽也可包括一个或多个本文所描述的用于“化学改变或衍生化的”氨基酸的修饰，例如，标记物或一个或多个翻译后修饰。

可使用本领域何已知的任方法制备和分离肽、衍生物和拟肽。可使用常规化学方法整体或部分地合成肽。产生肽和拟肽文库的技术是公知的，并包括例如，多针(multipin)、茶袋、分裂偶联混合技术和SPOT合成。

偶联物

本发明也涉及包含与细胞穿膜肽或CPP连接的本发明的肽或其衍生物的偶联物。

事实上，为了促进根据本发明的肽或其衍生物跨越细胞膜(例如细胞质膜)的吸收，发明人已证明将那些肽或其衍生物与“细胞穿膜肽”(CPP)偶联是非常有用的。CPP是可与运送的物质偶联以促进跨膜转运的公知的肽。CPP例如Lebleu B.等，Advanced Drug Delivery Reviews 60(2008)517-529和Hassane F.等，Cell.Mol.Life Sci.(2010)67：715-726描述。任何CPP可用以改善根据本发明的片段或其衍生物的胞质递送。

可与根据本发明的DAXX或FADD片段或其衍生物偶联的CPP的实例包括，但不限于：

其中：

-X＝氨基己基、β-丙氨酰基、对氨基苯甲酰基、异哌啶甲酰基(isonipecotyl)或4-氨基丁酰基

-B＝β-丙氨酸

-小写字母＝D-氨基酸(D-氨基酸可被L-氨基酸替代)。

CPP通常具有两个或更多个阳离子氨基酸，以疏水氨基酸或间隔基团分隔某些阳离子氨基酸。例如，阳离子氨基酸为精氨酸(R)。再通常地，CPP一般具有至少3或4个精氨酸残基。在某些实施方案中，CPP含有5、6或更多个精氨酸残基。

CPP通常连接至根据本发明的肽或其衍生物的N-端或C-端，优选连接至C-端。化学连接可通过任何化学键例如二硫键、硫醚或硫醇-马来酰亚胺连接实现。

在特定实施方案中，根据本发明的肽或其衍生物通过接头连接至CPP。技术人员可使用任何类型的接头，只要所述接头允许肽或其衍生物化学与CPP连接。多种接头是可能的，包括具有允许形成二硫键、硫醚或硫醇-马来酰亚胺连接的C-端半胱氨酸残基的氨基酸序列。将根据本发明的肽或其衍生物连接至CPP的其它方式包括使用C-末端醛以形成肟。另外的其它接头使用Click化学作用(Click chemistry)。

适合的接头的实例包括，但不限于选自下组的氨基酸或氨基酸序列：C、BC、XC、GC、BBCC、BXCC、XBC、X、XX、B、BB、BX和XB，

其中：

-X＝氨基己基、β-丙氨酰基、对氨基苯甲酰基、异哌啶甲酰基或4-氨基丁酰基

-B＝β-丙氨酸。

应用

本发明还涉及用于治疗人或动物体的方法中的如本文所述的肽、其衍生物及其偶联物，并涉及相应的治疗方法。更具体地，本发明涉及用于治疗人或动物体中与细胞凋亡相关的疾病或病症和/或用于抑制人或动物体中细胞凋亡的方法的肽、其衍生物及其偶联物。本发明也提供用于在需要治疗的受试者中治疗与细胞凋亡相关的疾病或病症和/或抑制细胞凋亡的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据本发明的肽、其衍生物和/或其偶联物的步骤。在某些实施方案中，向受试者施用至少一种根据本发明的抗凋亡DAXX-肽和至少一种根据本发明的抗凋亡FADD-肽。

如本文所用，术语“与细胞凋亡相关的疾病或病症”是指任何由细胞凋亡引起、导致细胞凋亡或包括细胞凋亡的疾病或临床病症。在某些实施方案中，疾病或病症与Fas受体介导的细胞凋亡相关。术语“与细胞凋亡相关的疾病或临床病症”也包含任何引起细胞凋亡、导致细胞凋亡或诱导细胞凋亡并由于受试者中疾病或临床病症的存在而进行的医学过程。

因此，根据本发明的肽、其衍生物和其偶联物及治疗方法可用以治疗人或动物体中的急性心肌梗死(AMI)、脑梗塞或急性循环扰动(休克状态)，且特别地可用于抑制或减少与这些疾病相关的细胞凋亡。根据本发明的肽、其衍生物和其偶联物及治疗方法也可用以治疗进行器官移植(例如，肝脏、心脏、肾脏、胰岛和小肠移植物)、心脏介入术(再灌注治疗、体外循环例如作为心肺旁路和临时血管阻塞)的受试者，且特别地可用于抑制或减少由这些医疗过程所引起的细胞凋亡。

根据本发明的肽、其衍生物和其偶联物及治疗方法可用于治疗人或动物体中的局部缺血，例如心肌缺血、肾脏缺血、缺血性结肠炎、肠系膜缺血、脑缺血、肢体缺血或皮肤缺血，且特别地可用于抑制或减少与缺血相关的细胞凋亡。

根据本发明的肽、其衍生物和其偶联物及治疗方法可用于治疗正在接受或已接受再灌注的受试者，且特别地可用于抑制或减少与再灌注损伤相关的细胞凋亡。

所有根据本发明的肽、其衍生物和其偶联物可在局部缺血之前或期间、在再灌注之前、同时或之后施用。

通过Fas受体介导的细胞凋亡也已被证实涉及人肝脏疾病，包括病毒性肝炎、威尔森氏症、酒精肝、胆汁淤积性肝病，和涉及自体免疫性疾病(综述于，例如，Ehrenschwender等，Adv.Exp.Med.Biol.，2009，647：64-93中)。因此，根据本发明的肽、其衍生物和其偶联物及治疗方法也可用于治疗这些疾病。

在根据本发明的治疗方法中，肽、其衍生物或其偶联物可与其它治疗剂，特别是用于治疗细胞凋亡、局部缺血和/或再灌注损伤的药剂联用。特别地，与靶向于细胞凋亡的内源性途径(即线粒体途径)的试剂的联合治疗是令人非常感兴趣的。因此，在相关方面中，本发明提供与其它治疗剂，特别是用于治疗细胞凋亡、局部缺血和/或再灌注损伤的药剂联合用于根据本发明治疗方法中的肽、其衍生物或其偶联物。在一个实施方案中，根据本发明的治疗方法还包括向所述人或动物体施用环孢霉素A和/或BH4肽的步骤。事实上，环孢霉素A证明抑制线粒体PTP开放，和减少AMI患者和动物模型中的梗死面积(Gomez等，Cardiovasc Res.2009；83(2)：226-33；Piot等，N Engl J Med.2008；359(5)：473-81；Mewton al，J Am Coll Cardiol.2010 Mar 23；55(12)：1200-5)。来自抗凋亡Bcl-xl蛋白的BH4已报道作为Tat蛋白质的偶联物在再灌注时施用时，有效减少在缺血-再灌注期间的细胞凋亡(Ono等，Eur J Cardiothorac Surg.2005，27(1)：117-121；Donnini等，细胞Cycle 2009；8(8)：1271-1278；Boisguerin等，J.Control Release，2011，doi：10.1016/jjconrel.2011.07.037)。

在根据本发明的治疗方法中，可使用许多合适途径中的任何一种施用所有化合物(肽、衍生物、偶联物、组合产品)，包括但不限于静脉内、肠胃外、动脉内、肌内、口服和经鼻。本发明的肽、其衍生物或其偶联物以所施用量对于预期目标有效的剂量施用。施用途径、制剂(见下文)和施用剂量将取决于所需的治疗效果、待治疗病症(如果已经存在)的严重性、任何感染的存在、患者的年龄、性别、体重和总体健康状况以及取决于所用肽、衍生物或偶联物的效力、生物利用度和体内半衰期、伴随治疗的使用(或不使用)以及其它临床因素。这些因素可在治疗过程中由主治医师容易地确定。

根据本发明的治疗可由单剂量或多剂量组成。因此，肽、其衍生物或偶联物的施用可以对于某些时期段是恒定的、或者是周期性和按照特定时间间隔(例如，每小时、每天、每周(或某些其它多天间隔)等)。或者，施用对于某些时期可以是连续递送的，例如，静脉内递送。

药物组合物

如上所述，本发明的肽、其衍生物或其偶联物可以本身施用或作为药物组合物施用。因此，本发明提供包含有效量的至少一种本发明的抗凋亡肽(或其衍生物或其偶联物)和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在某些实施方案中，该组合物进一步包含至少一种另外的生物活性剂。在某些实施方案中，药物组合物包含至少一种根据本发明的抗凋亡DAXX-肽和至少一种根据本发明的抗凋亡FADD-肽。

根据本发明的药物组合物可以对于实现所需预防和/或治疗效果有效的任意量和使用任何施用途径来施用。最佳药物制剂可根据施用途径和所需剂量而变化。这种制剂可影响所施用的活性成分的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。

本发明的药物组合物可以配制为单位剂型以方便施用和实现剂量的均匀性。如本文所用，表述“单位剂型”是指至少一种本发明的肽(或至少一种其衍生物或其偶联物)和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂的物理上分离的单元。然而，应理解组合物的每日总剂量将由主治医师在合理医疗判断的范围内决定。

制剂。可根据已知技术、使用适合的分散或润湿剂和悬浮剂配制可注射制剂，例如，无菌注射水性或油性悬浮液。无菌注射制剂也可为于非毒性肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液、悬浮液或乳液，例如，作为2，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的溶媒和溶剂为水、林格氏液(Ringer’s solution)、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发油常规地用作溶液或悬浮介质。为此目的，可使用任何温和的不挥发油，包括合成单-或二-甘油酯。脂肪酸例如油酸也可用于可注射制剂的制备中。无菌的液体载体可用于肠胃外施用的无菌液体形式组合物中。

可注射制剂可进行灭菌处理的，例如，通过经细菌截留过滤器的过滤或通过引入可在使用前溶解于或分散于无菌水或其它无菌注射介质中的无菌固体组合物形式的杀菌剂。作为无菌溶液或悬浮液的液体药物组合物可通过，例如，静脉内、肌内、腹膜内或皮下注射施用。注射可经由单次推注或通过逐步输注进行。当必需或希望时，组合物可包含局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。

为了延长活性成分的效果，通常希望延缓成分自皮下或肌内注射的吸收。肠胃外施用的活性成分的延迟吸收可通过将成分溶解或悬浮于油溶媒中实现。可注射的储库形式通过在可生物降解的聚合物例如聚乳酸-聚乙交酯中形成活性成分的微包被基质来制备。取决于活性成分与聚合物的比例和所用具体聚合物的性质，可控制成分的释放速率。其它可生物降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储库型注射制剂也可通过将活性成分封闭于与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。

用于口服施用的液体剂型包括，但不限于，药学上可接受乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆、酏剂和加压组合物。除了活性成分，液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如，水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯及其混合物。除了惰性稀释剂，口服组合物也可包括佐剂例如润湿剂、悬浮剂、防腐剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、增稠剂、色素、粘度调节剂、稳定剂或渗透压调节剂(osmo-regulator)。用于口服施用的适合的液体载体的实例包括水(可能含有如上添加剂，例如，纤维素衍生物，例如羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括单元醇和多元醇例如二醇类)和它们的衍生物，和油(例如，分馏椰子油和花生油)。对于加压组合物，液体载体可为卤代烃或其它药学上可接受的推进剂。

用于口服施用的固体剂型包括，例如，胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒剂。在这种固体剂型中，本发明的肽(或其衍生物或其偶联物)可与至少一种惰性的、生理上可接受的赋形剂或载体例如柠檬酸钠或磷酸二钙和以下一种或多种组分混合：(a)填充剂或填料例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂例如甘油；(d)崩解剂例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(e)溶液缓凝剂(solution retarding agent)例如石蜡；吸收促进剂例如季铵化合物；(g)润湿剂，例如，十六烷醇和甘油单硬脂酸酯；(h)吸附剂例如高岭土和膨润土；和(i)润滑剂例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠和其混合物。其它适用于固体制剂的赋形剂包括表面改性剂例如非离子和阴离子表面改性剂。表面改性剂的代表性实例包括，但不限于，泊洛沙姆188、苯扎氯铵、硬脂酸钙、十六十八醇、聚西托醇乳化蜡、山梨聚糖酯、胶体二氧化硅、磷酸盐、十二烷基硫酸钠、硅酸铝镁和三乙醇胺。在胶囊、片剂和丸剂的情况中，剂型也可包含缓冲剂。

利用这类赋形剂如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等，相似类型的固体组合物也可用作软质和硬质填充明胶胶囊中的填充剂。可制备具有包衣和外壳例如肠溶包衣、控释包衣和其它药物配制领域所熟知的包衣的片剂、糖锭剂、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型。它们可任选地包含遮光剂并也可以是组合物以使得它们仅或优选地在肠道的特定部分中、任选地以延迟的方式释放活性成分。可用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。

在某些实施方案中，可能期望在需要治疗的区域(例如，心肌)中局部施用本发明的抗凋亡肽(或其衍生物或其偶联物)。这可以例如但不限于，通过在经皮冠状动脉腔内成形术期间或在冠状动脉搭桥手术期间的局部输注来实现。

对于局部施用，药物组合物优选配制成凝胶、药膏、洗剂、或霜剂，其可包括载体例如水、甘油、醇、丙二醇、脂肪醇、三甘油酯、脂肪酸酯或矿物油。其它局部载体包括液体石油、棕榈酸异丙酯、聚乙二醇、乙醇(95％)、水中的聚氧乙烯单月桂酸酯(5％)或水中的十二烷基硫酸钠(5％)。需要时可添加其它物质例如抗氧剂、湿润剂、粘度稳定剂和类似试剂。

此外，在某些情况中，预期本发明组合物可置于放置在皮肤之上、之中或之下的透皮装置内。这种装置包括贴片、植入物和注射剂，其通过被动或主动释放机制释放活性成分。透皮施用包括跨越身体表面和身体通道内衬(包括上皮和粘膜组织)的全部施用方式。这种施用可使用洗剂、霜剂、泡沫剂、贴片、悬浮液、溶液和栓剂形式的本组合物来实现。

用于生产各种制剂的材料和方法是本领域已知的并可适用于实施本发明。用于递送抗体的适合的制剂可见于，例如，“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，E.W.Martin，第18版，1990，Mack Publishing Co.：Easton，PA中。

另外的生物活性剂。在某些实施方案中，本发明的肽是本发明药物组合物中的唯一活性成分。在其它实施方案中，药物组合物进一步包含一种或多种生物活性剂。适合的生物活性剂的实例包括，但不限于，抗凋亡剂、抗炎剂、免疫调节剂、止痛剂、抗微生物剂、抗菌剂、抗生素、抗氧化剂、防腐剂及其组合。

在某些实施方案中，另外的生物活性剂选自环孢霉素A、BH4及其组合。

在这种药物组合物中，本发明的抗凋亡肽(或其衍生物或其偶联物)和另外的治疗剂可以以一种或多种用于的同时、分别或顺次施用不同成分的制剂组合。更具体地，本发明组合物可以以使得肽(或其衍生物或其偶联物)和治疗剂可以一起施用或彼此独立施用的方式配制。例如，肽(或其衍生物或其偶联物)和治疗剂可以一起配制成单一组合物。或者，它们可单独地保存(例如，在不同的组合物和/或容器中)和施用。

实施例

以下实施例描述了得到和实施本发明的一些优选的方式。然而，应当理解这些实施例仅用于说明目的，并且不意味着限制本发明的范围。

膜结合的反相肽阵列的合成

肽在N-修饰的CAPE-膜上合成(Bhargava等，Mol.Recognit，2002，15：145)并且通过MultiPep SPOT-机器人(INTAVIS Bioanalytical Instruments AG，Cologne，德国)制备。在内置软件LISA 1.71的帮助下进行阵列设计。使用标准方案以点定义开始合成[Frank，Tetrahedron，1992，48：9217]，随后是Fmoc-半胱氨酸-(Trt)-Opfp(0.3M)的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液和Fmoc-丙氨酸-Opfp的偶联(双重偶联，各15分钟反应)。用DMF(20％)中的哌啶进行Fmoc切割后，添加溶于二甲基甲酰胺(DMF，0.6M溶液)中并且用EEDQ(1.1当量)活化的4-羟甲基苯氧乙酸(HMPA)，并且将样品直接点样在膜上(4x偶联，各15分钟反应)。将该膜用DMF(2％)中的乙酸酐乙酰化，用DMF(5x3分钟)、乙醇(2x3分钟)和二乙醚(2x3分钟)洗涤，并且最终空气干燥。将用1，1’-碳基二咪唑(CDI，3当量)活化的Fmoc-氨基酸-OH(0.4M)的DMF溶液点样在膜上(4x偶联，各15分钟反应时间)。将脯氨酸、酪氨酸和谷氨酸用1，1’-碳基二(1，2，4-三唑)(CDT)活化。Fmoc基团从点样点移除，并且使用标准SPOT合成方案完成肽序列(Frank，Tetrahedron，1992，48：9217)，随后用β-丙氨酸进行N-末端标记。

对于标准SPOT合成，使用带有以下侧链保护的Fmoc-aa-Opfp：E-、D-(OtBu)；C-、S-、T-、Y-(tBu)；K-、W-(Boc)；N-、Q-、H-(Trt)；R-(Pbf)。对于硫醚环化，所有的肽用在DMF(1M)中的溴乙酸2，4-二硝基苯基酯进行N-酰化，双重偶联，各15分钟反应时间。

将该膜用DMF(3x3分钟)和二氯甲烷(DCM，3x3分钟)洗涤并且干燥。为使得能够环化，用在DCM中的三氟乙酸(TFA，7％)、水(2％)(1x5分钟)和随后用在DCM中的TFA(7％)、TIBS(3％)、水(2％)切割半胱氨酸的三苯甲基侧链保护基。用DCM(3x3分钟)、DMF(2x3分钟)和DMF(2x3分钟)洗涤该膜。通过用25％Cs₂CO₃/DMF(1∶1)水溶液处理将肽环化过夜。用DMF(2x3分钟)、H₂O(2x3分钟)、乙醇(2x3分钟)和二乙醚(2x3分钟)洗涤该膜并且空气干燥。

通过在不振摇的情况下用在DCM中的TFA(60％)、TIBS(3％)和水(2％)处理2.5小时的一次处理实现水解和侧链脱保护，随后是洗涤步骤(DCM 3x3分钟，DMF 3x3分钟，乙醇3x3分钟，二乙醚2x3分钟)，随后在不振摇的情况下用在DCM中的TFA(90％)、TIBS(3％)和水(2％)处理30分钟。用DCM(3x3分钟)，DMF(3x3分钟)、乙醇(2x3分钟)、磷酸盐缓冲液(pH 7.4，0.1M，2x3分钟)、水(2x3分钟)、乙醇(2x3分钟)和二乙醚(2x3分钟)洗涤该膜并且空气干燥。

根据本发明的片段的设计和递送

将DAXX蛋白(SEQ ID NO：1)的初级序列分割成重叠的15聚体肽(3个氨基酸位移)，并且通过上述的SPOT合成在纤维素膜上合成所有肽(243个肽)。肽文库与Fas受体(Sigma)的His-标记的细胞内区域一起温育。使用抗-His(小鼠)/抗-小鼠-HRP的夹心法测定Fas和肽之间的相互作用，并且使用如图1A所示的LumiImager(罗氏)显示信号。发现点No.211(SEQ ID NO：2)显示最高的信号强度且发现点No.209、210和212(分别为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：7)包括最小表位序列(KSRKEKKQT)。

然而，15聚体序列KSRKEKKQTGSGPLG(点211，SEQ ID NO：2)和SGPPCKKSRKEKKQT(点209，SEQ ID NO：3)的序列长度分析表明不可能将序列任意缩短至图1中发现的最小表位。使用如以上所提到的SPOT合成，通过在N-端、C-端和在两个方向上缩短给定的序列来分析肽长度的影响(图2A)。显示最高信号强度的肽序列在图2B中显示。

进行了DAXXp-211和DAXXp-209(其对应于16聚体肽(KKSRKEKKQTGSGPLG)，称为DAXX肽或DAXXp(SEQ ID NO：5))的最高信号强度的合并组合。发现DAXXp具有重要的体外和体内抗凋亡活性。

按照以下事实有可在C-端延长肽：显性阴性蛋白(DAXX-DN)[Roubille等，Circulation，2007；116：2709-2717]包括由DAXXp-211肽延伸直至DAXX蛋白的C-端的区域(图1B)。

在AMI中的应用

测试了与CPP偶联或未偶联的DAXXp肽在原代心肌细胞中的抗凋亡活性和它们在全身施用后在小鼠手术I/R模型中降低梗死面积的能力。

体外评价

在第一步中，表1中列出的肽的细胞摄取使用流式细胞术测量(FACS-具有CF标记的肽)在小鼠心肌细胞的原代细胞培养中测量，并且验证了不存在任何细胞毒性。

表1：在本研究中使用的CPP和CPP-DAXXp偶联物

X＝氨基-己酸；B＝β-丙氨酸，r＝D-精氨酸；对于FASC测量，肽用(5，6)-羧基荧光素(CF)进行N-端标记；所有的肽进行C-端酰胺化。scr＝DAXXp的错义形式；mDAXXp为人DAXXp的小鼠同源物。

已经研究的其它CPP-DAXXp衍生物显示于下表2中。

表2：研究的其它CPP-DAXXp衍生物。

此外，使用表面等离子体共振(SPR)技术(Biacore Life Science，Sweden)通过测量结合亲合力(Kd)交叉验证片段与Fas受体的细胞内区域的潜在相互作用。单独和与CPP结合的片段的结合亲合力在表3中总结。

表3：使用的结构体的结合亲合力(Kd，μM)的测量

所有的实验在Biacore仪器上进行。对于各种条件，将三个独立实验的平均值和相应的标准差作图。

其后，评价了这些肽抑制由十字孢碱诱导的细胞凋亡的能力。使用测量DNA片段化的细胞死亡检测ELISA^PLUS试剂盒(罗氏)测定细胞凋亡。

在大多数公开出版物中，现有技术中目前可获得的抗凋亡肽在细胞凋亡诱导之前3-4小时施用，其与临床应用的相关性较差。出于这一原因，在本研究中使用的方案包括将肽和十字孢碱一起施用。图5B分别清楚地显示了使用Tat-DAXXp在原代心肌细胞中DNA片段化降低了44％和使用Pip2b-DAXXp在原代心肌细胞中DNA片段化降低了55％。这在单独CPP或在Tat-scrDAXXp或Tat-ncDAXXp的阴性对照中没有观察到。富集因子如供应商所建议的计算(处理细胞的DNA片段化/未处理细胞的片段化)。为了更好地比较结果，将DNA片段化(通过富集因子描述)与十字孢碱处理的细胞(＝100％)相关联。

还在鼠NG118-15(神经元细胞的模型)(图5D)中、在鼠C2C12(肌肉细胞的模型)(图5A)中和在大鼠H9c2(心肌细胞的模型)(图5C)中分析了肽的抗凋亡作用。使用Bpep-DAXXp在NG118-15中观察到DNA片段化的最高的降低(降低66％)，使用Tat-DAXXp在C2C12中观察到DNA片段化的最高降低(降低24％)和使用Pip2b-DAXXp在H9c2中观察到DNA片段化的最高降低(降低31％)。这清楚地表明最佳CPP选择对于适当的应用或生物背景的重要性。

此外，如上对于DAXX表位所述(详见上文)确定了FADD蛋白(SEQ ID NO：8)的结合表位。如图8A所示，对应于肽FADDp15(VGKRKLERVQSGLDL；SEQ ID NO：9)的点no.11具有较高的信号强度且点no.10和12(SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11)与FADDp15共有最小表位序列。

表4：来自与Tat CPP偶联的FADD蛋白的序列

利用分割该长度的肽文库，确定对应于FADDp(SEQ ID NO：12；KRKLERVQS)的FADDp15的最小片段(参见图8B)。在心肌细胞中，使用Tat-FADDp的偶联物，细胞凋亡的降低为35％，使用Tat-FADDp-15细胞凋亡的降低为57％(图9)。

体内评价

在第二步中，在心肌缺血-再灌注的体内模型中评价DAXXp的心脏保护作用。急性心肌缺血和再灌注在经历可逆性冠状动脉阻塞的手术模型的C57B16小鼠中进行。麻醉雄性小鼠(22-28g)并且使用哈佛啮齿动物呼吸器通过气管插管通气。通过热调节的手术台将体温保持在36.8℃至37.0℃。通过左侧开胸术打开胸腔并且将可逆冠状动脉网罗阻塞器(snare occluder)围绕左冠状动脉设置。将小鼠随机分配到两个不同的心肌缺血-再灌注的手术方案中(图11)。再灌注结束时，将动脉再阻塞并且将酞菁蓝染料注入左心室腔中并且允许灌注心肌的非缺血部分。为了测定DAXXp对心肌梗死面积的影响，在缺血-再灌注的手术方案期间在再灌注之前5分钟静脉内(尾静脉)施用肽。对照组用Tat或Pip2b肽(对于单独CPP)处理。选择1mg/kg的剂量(μ摩尔范围)并测试了对于0.1和10mg/kg的剂量响应。

再灌注结束时，将小鼠再次麻醉，确定地收紧冠状动脉绑扎，注射蓝色染料并且将收获的左心室用于梗死面积(TTC方法，Schwartz等，J Thromb.Thromb.，2000；10：181-187)或DNA片段化测量(细胞死亡检测ELISA^PLUS试剂盒，Roche Diagnostics)以研究对抗缺血-再灌注损伤的心脏保护作用。获得的结果在图12-15中显示。

当将Tat-DAXXp(1mg/kg)体内静脉注射时，在14、时再灌注后测量的梗死面积相对于单独Tat肽降低了53.4％(p＜0.01)(在各组间处于危险中的面积是相当的；p＝ns-图12A)。相对于注射Tat的小鼠，在注射Tat-DAXXp的小鼠左心室中这种心脏保护与特定DNA片段化(细胞凋亡的标志)的急剧降低相关(参见图12B)。这种心脏保护在Pip2b-DAXXp或单独CPP或在阴性对照Tat-scrDAXXp中未观察到(数据未显示)。

图13显示了当以0.1、1和10mg/kg注射时对于Tat-DAXXp的剂量响应，并且表明对于1mg/kg的剂量获得了最大的效应。单独注射的DAXXp(10mg/kg)(没有CPP)能够通过减少梗死面积和DNA片段化保护心肌，达到与Tat-DAXXp相同的程度。

当再灌注持续时间从1小时延长到24小时时，Tat-DAXXp的心脏保护作用得到维持(参见图14和15)。

共焦成像显示CF-Tat-DAXXp(1mg/kg)被定位于左心室中心肌细胞的细胞溶质和细胞核中(图16)。

在肾移植模型(大鼠)中进行的体内评价所获得的初步结果表明Tat-DAXXp(1mg/kg)能够对抗其它临床应用中的缺血-再灌注损伤。

在整个本申请中，各种参考文献描述了本发明所属的技术领域的状况。这些参考文献的公开内容在此通过引用并入到本发明的公开内容中。