一种检测口含烟制品对细胞微核率影响的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种检测口含烟制品对细胞微核率影响的方法，属于烟草及烟草制品 安全性生物学评价技术领域。
【背景技术】
[0002] 根据检测的遗传学终点不同，目前已建立的遗传毒性短期检测方法超过200种
[1]。细胞微核率是遗传毒性评价的关键组合指标之一，微核试验由于其检测终点明确，方 法简便，易于开展等特点，，在食品、医药产品、工农业产品、等健康相关产品的安全评价、遗 传损害的监测、特定人群的突变损伤检测和早期预报等方面得到了广泛的应用巧-5]。2009 年经济合作与发展组织（OECD)公布了哺乳动物体外微核试验指导文件，初步建立了哺乳动 物体外微核试验的统一标准[6]。国际烟草科学研究合作中屯、C0RESTA组织于2002年成立 了卷烟烟气体外毒理测试工作组，经过工作组大量的文献调研及研究工作，该工作组推荐 采用体外微核试验对卷烟烟气冷凝物潜在的遗传毒性进行检测。该检测方法目前已经被国 内外烟草公司广泛采用。
[0003] 烟草监管立法的日趋严格W及吸烟与健康研究的深入，导致了烟草公司寻求风险 更低、无环境烟气的新型烟草制品。口含烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混 合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。根据 产品的组分及形态特点，口含烟制品分为传统含烟叶原料的Snus型口含烟制品和不含烟 叶原料的新型口含烟制品巧日烟草含片)。口含烟制品的使用方式与传统卷烟吸入式不同， 口含烟制品直接经口使用，且其溶出物会随唾液进入消化系统，使用过程中不产生烟气，其 暴露途径显著有别于传统卷烟，检测对象的改变导致样品前处理方法、检测用细胞、检测剂 量也有所不同，用于检测传统卷烟遗传毒性的体外微核试验不能满足口含烟制品遗传毒性 检测的需要，且目前国内外研究机构及烟草公司尚未制定口含烟制品体外微核试验的标准 方法，因此，有必要针对口含制品自身特点建立适合口含烟制品的体外微核试验检测方法， 确保产品的安全性。
[0004] 上文设及的参考文献：
[1]Lynch AM，Sasaki JC，Elespuru R，et al. New and emerging technologies for genetic toxicity testing[J]. Environ Mol Mutagen，2011，52 (3) ;205-223。
[0005] [2]中华人民共和国卫生部.GB15193-2003食品安全性毒理学评价程序[S]。
[0006] [3]中华人民共和国农业部.GB 15670-1995农药登记毒理学试验方法[S]。
[0007] [4]中国食品药品监督管理局.YY/T 0127. 12-2008牙科学口腔医疗器械生物 学评价第2单元；试验方法微核试验[S]。
[000引[引国家质量监督检验检疫总局.SN/T 2178-2008危险品哺乳动物红细胞微核 试验方法[S]。
[0009] [6]Organization for Economic Cooperation and Development. Guideline for the testing of chemicals draft proposal for a new guideline 487 ；in vitro mammalian cell micronucleus test (MNvit)[S]，2009。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是为衡量口含烟制品的安全性，提供一种口含烟制品遗传毒性检测 的体外微核试验方法，在传统卷烟制品体外微核试验方法的基础上改进得到的一种适合于 口含烟制品遗传毒性检测的体外微核试验方法。
[0011] 本发明通过下列技术方案实现；一种检测口含烟制品对细胞微核率影响的方法， 经过下列各步骤： (1) 样品前处理方法：准确称取1.Og口含烟制品，加入30mL无血清培养基，于37°C下 恒温水浴锅中静置2化进行萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0. 45ym有 机滤膜过滤除菌，得到待测液； (2) 单细胞悬液的制备；人口腔粘膜成纤维细胞hOMF细胞于37°C、5%C02、95%RH (空气 相对湿度）培养箱中培养，待细胞汇合率约80~90%时移除培养基，用磯酸缓冲液洗两次， 弃洗液；加入lmk2mL浓度为0. 25% (w/v)的膜蛋白酶溶液进行单层解育1~2min，加入 DMEM/F12细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液； (3) 单细胞悬浮液的细胞浓度计算；用血球计数板计数法对步骤（2)所得单细胞悬浮 液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数； (4) 细胞接种；将步骤（3)计数后的单细胞悬浮液用DMEM/F12细胞培养基稀释至 1. 0~1. 5 X 1〇5个/mL，再按接种量为2mL/孔，接种到6孔细胞培养板中，将6孔细胞培养 板置于37°C、5%C02、95%RH (空气相对湿度）培养箱内培养2化； (5) 受试物分为S组；阴性对照组、阳性对照组和检测样品组；阴性对照组加DMEM/F12 细胞培养基；阳性对照组加浓度为0. 2yg/mL的环磯酷胺溶液；检测样品组加不同剂量的 步骤（1)所得待测液； (6) 剂量设定；W样品烟碱量作为检测剂量划分指标，设置4个非零剂量；1400yg/mL、 700yg/血、350yg/血、175yg/血； (7) 移除步骤（4)中6孔细胞培养板内的培养基，再按步骤（5)进行分组，在阴性对照 组相应的孔内加入DMEM/F12细胞培养基；在阳性对照组相应的孔内加浓度为0. 2yg/mL的 环磯酷胺溶液；在检测样品组相应的孔内加入步骤（1)所得待测液，使终浓度分别为步骤 (6)设定的剂量；阴性对照组、阳性对照组和检测样品组的终体积为2mL/孔；再在阴性对照 组、阳性对照组和检测样品组中均加入细胞松弛素，使其在每个细胞培养孔中的终浓度为 3yg/mL。
[001引 （8)解育受试物；将步骤（7)加样后的6孔细胞培养板置于37°C、5%0)2、95%RH (空 气相对湿度）培养箱中解育2化； (9) 收获细胞：用浓度为0. 25% (w/v)的膜蛋白酶溶液将细胞从步骤（8)解育后的6孔 细胞培养板的孔内分别消化下来，得到细胞悬浮液； (10) 低渗；将步骤（9)的细胞悬浮液进行离屯、分离，移除上清液后加入浓度为 0. 075mol/L的氯化钟溶液3mL并吹打细胞，混匀后立刻加入甲醇/冰醋酸溶液2mU再进行 离屯、分离，移除上清液； (11) 滴片；将步骤（10)中所得上清液用于吹打细胞，形成细胞悬浮液，再将细胞悬浮 液滴在载玻片上自然惊干； (12) 染色；将步骤（11)惊干后的载玻片放置于新配制的Gimsa染液中染色15min后， 再用自来水冲洗载玻片并自然惊干后保存备用； (13) 微核计数：挑选步骤（12)的载玻片，至少观察1000个双核细胞，并计数微核率； (14) 结果判定：将待测样品组的微核率与阴性对照组的相比，微核率有显著性增加并 有剂量反应关系的，即可确认为阳性结果。
[0013] 所述步骤（1)的无血清培养基为市购产品。
[0014] 所述步骤（2)中汇合率是通过倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况。
[0015] 所述步骤（10)的甲醇/冰醋酸溶液是将甲醇和冰醋酸按体积比4:1的比例混匀 配制而成。
[0016] 所述步骤（10)的离屯、分离是在lOOOrmp的转速下离屯、分离5min。
[0017] 所述步骤（11)的载玻片为每孔平行滴3片。
[0018] 所述步骤（13)的挑选是良好且细胞密度适宜的视野，观察的双核细胞应为细胞质 保存完好，细胞膜边界清晰，细胞核相互分开，微核易于分辨。
[0019] 步骤（14)中若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验， 能重复者可确定为阳性。
[0020] 本发明方法与现有技术方法相比，优点在于；综合考察口含烟制品的暴露途径，作 用方式，建立了 口含烟制品样品前处理方法，且根据口含烟制品作用祀细胞选取了人口腔 粘膜成纤维细胞hOMF作为口含烟制品体外微核试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量， 形成了适合口含烟制品的体外微核试验检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设 定W及祀细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测口含烟制品对细胞微核率的影 响。
【具体实施方式】
[0021] 下面将结合具体实例对本发明做详细描述，但并不限制本发明。
[0022] 实施例1 用于骆驼（Camel)品牌薄荷口味Snus型口含烟制品遗传毒性的检测。
[002引 （1)样品前处理方法：准确称取1. Og骆驼（Camel)品牌薄荷口味Snus型口含烟制 品，加入30血市购无血清培养基，于37 °C下恒温水