浴锅中静置2化进行萃取，萃取后先用定 性滤纸进行初滤除渣处理，再用0. 45 y m有机滤膜过滤除菌，得到待测液； (2) 单细胞悬液的制备；人口腔粘膜成纤维细胞hOMF细胞于37°C、5%C02、95%RH (空气 相对湿度）培养箱中培养，通过倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞汇合率 约80~90%时移除培养基，用磯酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1血-2血浓度为0. 25% (w/ V)的膜蛋白酶溶液进行单层解育1~2min，加入DMEM/F12细胞培养基悬起，形成单细胞悬 浮液； (3) 单细胞悬浮液的细胞浓度计算；用血球计数板计数法对步骤（2)所得单细胞悬浮 液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数； (4) 细胞接种；将步骤（3)计数后的单细胞悬浮液用DMEM/F12细胞培养基稀释至 1. 0~1. 5 X 105个/mL，再按接种量为2mL/孔，接种到6孔细胞培养板中，将6孔细胞培养 板置于37°C、5%C02、95%RH(空气相对湿度）培养箱内培养2化； (5) 受试物分为S组；阴性对照组、阳性对照组和检测样品组；阴性对照组加DMEM/F12 细胞培养基；阳性对照组加浓度为0. 2 y g/mL的环磯酷胺溶液；检测样品组加不同剂量的 步骤（1)所得待测液； (6) 剂量设定；W样品烟碱量作为检测剂量划分指标，设置4个非零剂量；1400yg/mL、 700yg/血、350yg/血、175yg/血； (7) 移除步骤（4)中96孔细胞培养板内的培养基，再按步骤（5)进行分组，在阴性对照 组相应的孔内加入DMEM/F12细胞培养基；在阳性对照组相应的孔内加浓度为0. 2 y g/mL的 环磯酷胺溶液；在检测样品组相应的孔内加入步骤（1)所得待测液，使终浓度分别为步骤 (6)设定的剂量；阴性对照组、阳性对照组和检测样品组的终体积为2mL/孔；再在阴性对照 组、阳性对照组和检测样品组中均加入细胞松弛素，使其在每个细胞培养孔中的终浓度为 3 y g/mL。
[0024] (8)解育受试物；将步骤（7)加样后的6孔细胞培养板置于37°C、5%0)2、95%RH(空 气相对湿度）培养箱中解育2化； (9) 收获细胞：用浓度为0. 25% (w/v)的膜蛋白酶溶液将细胞从步骤（8)解育后的6孔 细胞培养板的孔内分别消化下来，得到细胞悬浮液； (10) 低渗；将步骤（9)的细胞悬浮液进行离屯、分离，移除上清液后加入浓度为 0. 075mol/L的氯化钟溶液3mL并吹打细胞，混匀后立刻加入甲醇/冰醋酸溶液2mL (甲醇 和冰醋酸按体积比4:1的比例混匀)，再在lOOOrmp的转速下离屯、分离5min，移除上清液； (11) 滴片；将步骤（10)中所得上清液用于吹打细胞，形成细胞悬浮液，再将细胞悬浮 液滴在载玻片上自然惊干，载玻片为每孔平行滴3片； (12) 染色；将步骤（11)惊干后的载玻片放置于新配制的Gimsa染液中染色15min后， 再用自来水冲洗载玻片并自然惊干后保存备用； (13) 微核计数：挑选步骤（12)的载玻片，从微核玻片中选择良好且细胞密度适宜的视 野，观察的双核细胞应为细胞质保存完好，细胞膜边界清晰，细胞核相互分开，微核易于分 辨，至少观察1000个双核细胞，并计数微核率； (14) 结果判定：将待测样品组的微核率与阴性对照组的相比，微核率有显著性增加并 有剂量反应关系的，即可确认为阳性结果。若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系 时，则须进行重复试验，能重复者可确定为阳性。
[0025] 经过改进前处理方法、检测用细胞、检测剂量后对骆驼（Camel)品牌薄荷口味 Snus型口含烟制品的遗传毒性进行了检测，结果见表1 ; 表1骆驼（Camel)品牌薄荷口味Snus型口含烟制品体外微核试验检测结果
【主权项】
1. 一种检测口含烟制品对细胞微核率影响的方法，其特征在于经过下列各步骤： (1) 样品前处理方法：准确称取1.0 g 口含烟制品，加入30mL无血清培养基，于37°C下 静置24h进行萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0. 45 y m有机滤膜过滤除 菌，得到待测液； (2) 单细胞悬液的制备：人口腔粘膜成纤维细胞hOMF细胞于37°C、5%C02、95%RH培养 箱中培养，待细胞汇合率约80~90%时移除培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入 lmL-2mL浓度为0. 25% (w/v)的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1~2min，加入DMEM/F12细胞 培养基悬起，形成单细胞悬浮液； (3) 单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2)所得单细胞悬浮 液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数； (4) 细胞接种：将步骤（3)计数后的单细胞悬浮液用DMEM/F12细胞培养基稀释至 I. 0~I. 5 X IO5个/mL，再按接种量为2mL/孔，接种到6孔细胞培养板中，将6孔细胞培养 板置于37°〇、5%0) 2、95%冊培养箱内培养2411; (5) 受试物分为三组：阴性对照组、阳性对照组和检测样品组；阴性对照组加DMEM/F12 细胞培养基；阳性对照组加浓度为〇. 2 y g/mL的环磷酰胺溶液；检测样品组加不同剂量的 步骤（1)所得待测液； (6) 剂量设定：以样品烟碱量作为检测剂量划分指标，设置4个非零剂量：1400 y g/mL、 700 y g/mL、350 y g/mL、175 y g/mL ; (7) 移除步骤（4)中6孔细胞培养板内的培养基，再按步骤（5)进行分组，在阴性对照 组相应的孔内加入DMEM/F12细胞培养基；在阳性对照组相应的孔内加浓度为0. 2 y g/mL的 环磷酰胺溶液；在检测样品组相应的孔内加入步骤（1)所得待测液，使终浓度分别为步骤 (6)设定的剂量；阴性对照组、阳性对照组和检测样品组的终体积为2mL/孔；再在阴性对照 组、阳性对照组和检测样品组中均加入细胞松弛素，使其在每个细胞培养孔中的终浓度为 3V-g/mL ； (8) 孵育受试物：将步骤（7)加样后的6孔细胞培养板置于37°C、5%C02、95%RH培养箱 中孵育24h ; (9) 收获细胞：用浓度为0. 25% (w/v)的胰蛋白酶溶液将细胞从步骤（8)孵育后的6孔 细胞培养板的孔内分别消化下来，得到细胞悬浮液； (10) 低渗：将步骤（9)的细胞悬浮液进行离心分离，移除上清液后加入浓度为 0. 075mol/L的氯化钾溶液3mL并吹打细胞，混匀后立刻加入甲醇/冰醋酸溶液2mL，再进行 离心分离，移除上清液； (11) 滴片：将步骤（10)中所得上清液用于吹打细胞，形成细胞悬浮液，再将细胞悬浮 液滴在载玻片上自然晾干； (12) 染色：将步骤（11)晾干后的载玻片放置于新配制的Gimsa染液中染色15min后， 再用自来水冲洗载玻片并自然晾干后保存备用； (13) 微核计数：挑选步骤（12)的载玻片，至少观察1000个双核细胞，并计数微核率； (14) 结果判定：将待测样品组的微核率与阴性对照组的相比，微核率有显著性增加并 有剂量反应关系的，即可确认为阳性结果。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1)的无血清培养基为市购产 品。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2冲汇合率是通过倒置显微镜 观察培养细胞的汇合和形态情况。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（10)的甲醇/冰醋酸溶液是将 甲醇和冰醋酸按体积比4:1的比例混匀配制而成。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（10)的离心分离是在1000 rmp 的转速下离心分离5min。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（11)的载玻片为每孔平行滴3 片。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（13)的挑选是良好且细胞密度 适宜的视野，观察的双核细胞应为细胞质保存完好，细胞膜边界清晰，细胞核相互分开，微 核易于分辨。
【专利摘要】本发明提供一种检测口含烟制品对细胞微核率影响的方法，经过样品前处理方法、单细胞悬液的制备、细胞浓度计算、细胞接种、加入受试物、孵育受试物、收获细胞、低渗、滴片、染色、微核计数、结果判定等步骤。本发明综合考察口含烟制品的暴露途径，作用方式，建立了口含烟制品样品前处理方法，且根据口含烟制品作用靶细胞选取了人口腔粘膜成纤维细胞hOMF作为口含烟制品体外微核试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合口含烟制品的体外微核试验检测方法。
【IPC分类】G01N33-50
【公开号】CN104749353
【申请号】CN201510193409
【发明人】李雪梅, 管莹, 夭建华, 高茜, 陈建华, 杨叶昆, 米其利, 朱洲海
【申请人】云南中烟工业有限责任公司
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年4月22日