H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重rt-pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有两对特异性引物。本发明具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，应用本发明可建立H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒的二重PCR的检测方法，实现同时检测和鉴别H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒两种病原体，用于H9亚型禽流感病毒感染造成的免疫力减低导致的鸭坦布苏病毒的混合感染，既可以节约时间的成本，又可以减少污染。
【专利说明】H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重RT-PCR检测试剂
盒
【技术领域】
[0001]本发明属于RT-PCR检测【技术领域】，尤其涉及一种H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重RT-PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]鸭坦布苏病毒(TMUV)首先发现于2010年中国福建、浙江、江苏等东部沿海地区，并逐渐蔓延至全国大部分地区。鸭坦布苏病毒感染鸭后可导致蛋鸭产蛋量严重下降，产蛋率可从90%降至10%以内，甚至绝产；感染雏鸭后可导致雏鸭出现站立不稳、倒地不起等神经症状，进而导致雏鸭淘汰率升高，严重地高达80%，给养鸭业带来了极大的经济损失。禽流感是由正黏病毒科A型流感病毒属中不同亚型病毒引起的禽类感染和疾病的总称。H9亚型禽流感病毒(H9AIV)—般呈低至中等毒力，但它分布广泛、能造成鸭的免疫抑制进而引发与其它鸭病的混合感染，产蛋鸭感染后也可引起产蛋率的明显下降，极大影响了蛋鸭的经济效益，因此它对养鸭业的危害也不可忽视。
[0003]由于H9亚型禽流感病毒引起鸭的咳嗽、呼吸困难、产蛋量下降等症状与鸭副粘病、减蛋综合症等疾病引发的症状较为相似，在临床上较难区分，而鸭坦布苏病毒也存在病毒活力低、滴度下降快等临床上较难检测的问题，因此迫切需要建立一种快速敏感的H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒的检测方法，在感染早期就能检测出这些病毒，从而为这些病的控制争取宝贵时间。
[0004]目前，这两种病毒的传统检测方法有血清中和试验、琼脂扩散试验和ELISA等，但这些检测存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性。
[0005]PCR技术实现了对模板的定量检测，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应等特点。在实际应用中，当样品量非常大时，单重PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。多重PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重PCR的不足。然而，建立二重PCR方法比单重要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同引物间无相互干扰。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便、敏感性高、特异性强、重复性好的H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重RT-PCR检测试剂盒，以实现同时检测和鉴别H9亚型禽流感病毒与鸭坦布苏病毒两种病原体。
[0007]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重RT-PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物I和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的喊基序列。
[0008]引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为0.5-1: 0.5-1:1:1。
[0009]引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为1:1:1:1。[0010]上述H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重RT-PCR检测引物组在二重PCR扩增方面的应用，二重PCR扩增的退火温度为50.0-60.1°C。
[0011]二重PCR扩增的退火温度为54.50C。
[0012]H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有以下试剂:
[0013]A液:PCR反应液，含2XTaq PCR Mix(购自全式金.AS111-12)、H9AIV上下游引物、TMUV上下游引物、ddH20, H9AIV上下游引物分别是引物I和2，TMUV上下游引物分别是引物3和4，引物1至4分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的碱基序列；
[0014]B液:H9AIV+TMUV模板，作为阳性对照；
[0015]C液:ddH20，作为阴性对照。
[0016]PCR 反应液含 2XTaq PCR Mix25 μ L、H9AIV 上下游引物各 0.8 μ 1、TMUV 上下游引物各1.2 μ 1、CldH2OL O μ L，其中各引物浓度均为50 μ mol/mL ；B液含H9AIV+TMUV模板各10μ L, C 液为 2μ L ddH20。
[0017]上述H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重RT-PCR检测试剂盒在二重PCR扩增方面的应用，二重PCR扩增的退火温度为50.0-60.1°C。
[0018]二重PCR扩增的退火温度为54.50C。
[0019]针对目前缺乏对H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒同时进行检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研究设计了两对特异性引物，据此建立了 H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒的二重RT-PCR的检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。本发明具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，应用本发明可同时检测和鉴别H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒两种病原体，用于H9亚型禽流感病毒感染造成的免疫力减低导致的鸭坦布苏病毒的混合感染，既可以节约时间的成本，又可以减少污染。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是二重PCR敏感性试验结果电泳图，图中:M.1OObp DNA ladder, 1.H9AIV的cDNA+鸭坦布苏病毒的cDNA (等体积混合)，2.H9AIV的cDNA，3.鸭坦布苏病毒的cDNA，
4.H5AIV的cDNA，5.番鸭呼肠孤病毒的cDNA，6.番鸭细小病毒的DNA，7.鸭圆环病毒DNA，
8.鸭副粘病毒的cDNA，9.鸭肝炎病毒的cDNA，10.鸭瘟病毒的DNA，11.鸭胚尿囊液的DNA，12.阴性对照(ddH20)。
[0021]图2是二重PCR特异性试验结果电泳图，图中:M.1OObp DNA ladder, 1.630ng H9亚型禽流感病毒cDNA和660ng鸭坦布苏病毒cDNA，2.63ng H9亚型禽流感病毒cDNA和66ng鸭坦布苏病毒cDNA，3.6.3ng H9亚型禽流感病毒cDNA和6.6ng鸭坦布苏病毒cDNA，
4.630pg H9亚型禽流感病毒cDNA和660pg鸭坦布苏病毒cDNA，5.63pg H9亚型禽流感病毒cDNA和66pg鸭坦布苏病毒cDNA，6.3pg H9亚型禽流感病毒cDNA和6.6pg鸭坦布苏病毒cDNA，7.阴性对照(ddH20)。
[0022]图3是二重PCR部分临床样品检测结果电泳图，图中:M.1OObp DNA ladder, I阳性对照(H9亚型禽流感病毒cDNA+鸭坦布苏病毒cDNA)，2-17分别为部分有目的条带的鸭病料检测结果。【具体实施方式】
[0023]以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下:
[0024]鸭瘟病毒AV1221购自中国兽医药品监察所。
[0025]鸭肝炎病毒AV2111株(以下简称为DHV I)购自中国兽医药品监察所。
[0026]番鸭细小病毒记载在“广西番鸭细小病毒的分离和鉴定”，广西畜牧兽医，2002，18 (6): 5-7，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0027]鸭圆环病毒记载在“广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查”，中国畜牧兽医，2010,37 (11): 156-158，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0028]鸭副粘病毒(鸭新城疫)记载在“鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重PCR检测方法的建立”，中国动物检疫，2012，29 (5):34-37，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0029]番鸭呼肠孤病毒记载在“番鸭花肝病病原的研究”，中国兽医科技，2003，5 (33):7-8，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0030]H5亚型禽流感病毒记载在“H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立”，南方农业学报，2013，02:323-327，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0031]H9亚型禽流感病毒记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立”，中 国人兽共患病学报，2006，(09):858-860，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0032]试剂:IOObpMarker ladder、2XTaq PCR Mix、DNA/RNA 提取试剂盒、反转录试剂均购自北京全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司；pMD18T vector试剂盒购自大连宝生物公司。
[0033]实施例1、引物的设计与合成
[0034]根据GenBank中H9AIV的HA基因与TMUV的NS2基因的保守序列，利用DNAStar软件进行多序列比对，在保守区用primer5.0设计引物。引物(见表1)由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
[0035]表1引物信息
[0036]
【权利要求】
1.H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重RT-PCR检测引物组，其特征在于包括两对特异性引物，分别是引物I和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的喊基序列。
2.根据权利要求1所述的H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重RT-PCR检测引物组，其特征在于:所述引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为0.5-1: 0.5-1: I: I。
3.根据权利要求2所述的H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重RT-PCR检测引物组，其特征在于:所述引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为1:1:1:1。
4.权利要求1所述H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重RT-PCR检测引物组在二重PCR扩增方面的应用，其特征在于:所述二重PCR扩增的退火温度为50.0-60.1°C。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述二重PCR扩增的退火温度为54.5°C。
6.一种H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂: A液:PCR反应液，含2XTaq PCR Mix(购自全式金.AS111-12)、H9AIV上下游引物、TMUV上下游引物、ddH20，H9AIV上下游引物分别是引物I和2，TMUV上下游引物分别是引物3和4，引物I至4分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的喊基序列； B液:H9AIV+TMUV模板，作为阳性对照； C液:ddH20，作为阴性对照。
7.根据权利要求6所述的H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于:所述PCR反应液含2XTaq PCR Mix25 μ L、H9AIV上下游引物各0.8 μ 1、TMUV上下游引物各1.2 μ 1、CldH2OLOyL,其中各引物浓度均为50 μ mol/mL ;所述B液含H9AIV+TMUV 模板 各 10 μ L,所述 C 液为 2 μ L ddH20。
8.权利要求7所述H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重RT-PCR检测试剂盒在二重PCR扩增方面的应用，其特征在于:所述二重PCR扩增的退火温度为50.0-60.1°C。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述二重PCR扩增的退火温度为54.5°C。
【文档编号】C12Q1/70GK103789454SQ201410066408
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月26日 优先权日:2014年2月26日
【发明者】谢芝勋, 赵虹, 谢丽基, 刘加波, 范晴, 庞耀珊, 罗思思, 邓显文, 谢志勤 申请人:广西壮族自治区兽医研究所