一种提高青霉产纤维素酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高青霉产纤维素酶的方法。该方法是将PDA培养基中复壮的青霉孢子接种到青霉种子培养基中培养，得到一级种子培养液；然后再将一级种子培养液接种到添加了荞麦提取液的发酵培养基中培养。本发明利用荞麦提取液作为青霉发酵培养基的添加剂，大幅度的提高青霉产纤维素酶酶活，方法简单易行，成本相对低廉，效果良好。
【专利说明】一种提高青霉产纤维素酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及提高酶活的方法，尤其涉及的是一种提高青霉产纤维素酶的方法。
【背景技术】
[0002]随着传统能源储备日渐衰竭，能源危机成为制约各国高速发展的重要因素，寻找并大力发展可持续再生资源成为全球热点问题之一。纤维素是全球数量最大的可再生资源，主要存在于植物的细胞壁中，每年全球光合作用产生的植物生物量高达1.145X IO12吨，而纤维素资源占地球总生物量的60%~80%。利用纤维素生产新型清洁能源及其他生物化学副产物是当今研究开发的热点。
[0003]我国拥有丰富的纤维素资源，仅秸杆皮壳一项，每年可达7亿多吨，其中玉米秸(35%)、小麦秸(21%)和稻草(19%)是我国的三大秸杆。2001年，我国开始实施燃料乙醇计划，至今已成为世界上仅次于巴西和美国的第三大燃料乙醇生产国。2007年，中国政府颁布的《可再生能源中长期发展规划》中指出，大力发展以非粮物质为燃料乙醇的生产原料，预计到2020年生物燃料乙醇的年利用量为1000万吨。
[0004]纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它们协同作用分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖。纤维素酶的复合酶系主要有3个成分，内切葡聚糖酶(1，4_β -D-glucangiucanohydrolase 或 endo-1，4_β -D-glucanase，E.C3.2.1.4，来自真菌简称 EG);外切葡聚糖酶(I, 4_β -D-glucan cel1biohydrolase 或exo-1,4_ β -D-glucanase, E.C3.2.1.91,来自真菌简称 CBH ;来自细菌简称 Cex)。β -葡萄糖苷酶(i3-l，4-g lucOS1-daSe，E.C3.2.1.21，简称86)。葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶主要溶解纤维素，β-葡萄糖苷酶主要是将纤维二糖、纤维三糖转化生成葡萄糖。经过多年的研究，纤维素酶已广泛运用于各个行业，如食品、纺织、酿酒、饲料、石油勘探、中药成分提取等。特别是在新能源、洗涤、造纸、纺织等行业占据着举足轻重的地位。
[0005]纤维素酶来源广泛，细菌、放线菌、丝状真菌等均能产生纤维素酶。其中真菌所产的纤维素酶酶系结构较全，且多为胞外酶，提取纯化较容易，产酶量较高，成本相对较低，是现在工业的王要囷种。研究较多的有木霉属、曲霉属、青霉属、根霉属和漆斑霉属。
[0006]荞麦中富含蛋白质、淀粉、矿物质、维生素及丰富的黄酮类化合物，这些物质作为生长因子能刺激纤维素产生菌的生长及纤维素酶的产生。目前，提高产纤维素酶菌酶活的主要方法是诱变育种及利用基因工程构建高产纤维素降解菌，这些方法步骤繁琐、代价较闻。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在提高纤维素酶菌酶活中存在的问题，提供了一种提高青霉产纤维素酶的方法。
[0008]本发明的技术方案如下:
[0009]一种提高青霉产纤维素酶的方法，其步骤如下:[0010](I)荞麦提取液的制备
[0011]将荞麦加入蒸馏水中浸泡Ih后，用电炉加热至沸腾，保持微沸30min，冷却至室温，用超声波破碎仪处理后，7000r/min离心15分钟，取上清液，即得到荞麦提取液；
[0012](2)—级种子培养
[0013]在无菌环境中，接种一环PDA培养基中复壮的青霉孢子至100ml青霉种子培养基中，在28°C，190r/min条件下培养48h，得到一级种子培养液；其中，青霉种子培养基的成分为:每IOOmL蒸懼水中含蛋白胨0.5g,葡萄糖1.0g,酵母浸出膏0.4g,硫酸镁0.05g,磷酸二氢钾0.2g,磷酸氢二钾0.4g ；
[0014](3)发酵培养
[0015]在无菌环境中，将(2)中制得的一级种子培养液接种至发酵培养基中，在28°C，185r/min条件下培养6d ;其中，发酵培养基的成分为:每100ml蒸懼水中含蛋白胨0.4g,酵母浸出膏0.05g,硫酸铵0.2g，磷酸二氢钾0.4g，淀粉3.0g,硫酸镁0.03g,微晶纤维素
3.6g，氯化钙0.03g,荞麦提取液IOml。
[0016]所述的方法，步骤(1)中，荞麦和蒸馏水的质量体积比为1:10。
[0017]所述的方法，步骤(1)中，超声破碎的处理参数为:总时间30min，超声波时间5s，间歇时间3s，功率50%。
[0018]所述的方法，步骤(3)中，一级种子培养液和发酵培养基的体积比为1:11。
[0019]本发明有益效果为:荞麦熬煮后体积`膨大，种皮破裂，有利于超声波破碎，超声波处理后，荞麦营养成分大部分溶解于水中，离心去除细胞壁细胞器等成分，得到较纯的荞麦提取液。本发明材料廉价易得，方法简单易行，荞麦提取液作为青霉发酵培养基的添加剂能有效的提高青霉产纤维素酶的酶活。
【具体实施方式】
[0020]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0021]实施例1荞麦提取液的制备
[0022]称取20g荞麦，加入200ml蒸馏水浸泡Ih后，电炉加热至沸腾，调整加热温度，保持微沸状态30min，此时荞麦已膨大变白。荞麦初提取液冷却至室温后进行超声波破碎，超声波破碎仪设定参数为功率50%、总时间30min、超声波时间5s，间歇时间3s。最后，在7000r/min下离心15min,取上清，即得到荞麦提取液。
[0023]实施例2 —级种子培养
[0024]准确称量蛋白胨0.5g、酵母膏1.0g、硫酸镁0.05g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸二氢钾
0.4g于250ml锥形瓶中并用80ml蒸馏水溶解，称取葡萄糖1.0g, 20ml蒸馏水溶解，两者灭菌冷却后，在超净工作台中，将葡萄糖溶液倒入250ml锥形瓶，并接种一环PDA培养基上的青霉孢子，在28°C, 190r/min条件下培养48h,得一级种子培养液。
[0025]实施例3发酵培养
[0026]准确称量蛋白胨0.2g，酵母浸出膏0.025g，硫酸铵0.lg，磷酸二氢钾0.2g，淀粉
1.5g，硫酸镁0.015g，氯化钙0.015g，蒸馏水50ml、微晶纤维素1.8g、荞麦提取液5ml，至于250ml锥形瓶中，依此做三个重复。灭菌冷却后，在无菌环境中，接种5ml实施例2制得的一级种子液，至于摇床中，280C，185r/min条件下培养6d。收集粗酶液后，测定CMC酶活为156.65U/ml，滤纸酶活为 24.78U/ml。
[0027]实施例4发酵培养
[0028]实施步骤如实施例3，只是培养基中不加入荞麦提取液，测定CMC酶活为58.48U/ml,滤纸酶活为9.66U/ml。
[0029]应当理解的是，对 本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
【权利要求】
1.一种提高青霉产纤维素酶的方法，其特征是，其步骤如下: (1)荞麦提取液的制备 将荞麦加入蒸馏水中浸泡Ih后，用电炉加热至沸腾，保持微沸30min，冷却至室温，用超声波破碎仪处理后，7000r/min离心15分钟，取上清液，即得到荞麦提取液； (2)—级种子培养 在无菌环境中，接种一环PDA培养基中复壮的青霉孢子至100ml青霉种子培养基中，在28°C,190r/min条件下培养48h，得到一级种子培养液；其中，青霉种子培养基的成分为:每IOOmL蒸懼水中含蛋白胨0.5g,葡萄糖1.0g,酵母浸出膏0.4g,硫酸镁0.05g,磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钾0.4g ； (3)发酵培养 在无菌环境中，将(2)中制得的一级种子培养液接种至发酵培养基中，在28°C，185r/min条件下培养6d ;其中，发酵培养基的成分为:每100ml蒸懼水中含蛋白胨0.4g,酵母浸出膏0.05g，硫酸铵0.2g，磷酸二氢钾0.4g，淀粉3.0g，硫酸镁0.03g，微晶纤维素3.6g，氯化钙0.03g，荞麦提取液10ml。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(1)中，荞麦和蒸馏水的质量体积比为1:10。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(1)中，超声破碎的处理参数为:总时间30min，超声波时间5s，间歇时间3s，功率50%。
4.根据权利要求1所·述的方法，其特征是，步骤(3)中，一级种子培养液和发酵培养基的体积比为1:11。
【文档编号】C12N9/42GK103820422SQ201410066355
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月26日 优先权日:2014年2月26日
【发明者】曾柏全, 冯金儒 申请人:中南林业科技大学