共表达摄取转运体和药物代谢酶模型的构建及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种共表达摄取转运体和药物代谢酶模型的构建，以人基因OAT1cDNA为模板，扩增获得人OAT1基因片段，连接到载体pcDNA3.1(+)，获得质粒pcDNA3.1(+)/OAT1，转染MDCK细胞，经筛选得到高表达OAT1的MDCK-hOAT1细胞；然后将人CYP1A2基因片度连接到载体pcDNA3.1/Hygro(+)，获得质粒pcDNA3.1/Hygro(+)/CYP1A2，转染MDCK-hOAT1细胞，经潮霉素B筛选，得到共表达OAT1和CYP1A2细胞，再对细胞进行mRNA验证并通过经典底物及抑制剂进行功能验证。本发明的细胞模型可在基于OAT1和CYP1A2的药物毒性作用在细胞水平上筛选中的应用，可预测这两种蛋白对药物处置过程中的协同作用，为临床合理用药提供依据。本发明设计合理，重复性强。
【专利说明】共表达摄取转运体和药物代谢酶模型的构建及应用
【技术领域】
[0001]本发明属生物【技术领域】，涉及一种共表达摄取转运体OATl和药物代谢酶CYP1A2细胞模型的构建及应用。
技术背景
[0002]药物进入体内之后往往会经过吸收、分布、代谢、排泄等过程。药物自体外或给药部位经过细胞组成的屏蔽膜进入血液循环，通过门静脉进入肝脏，受到肝脏内药物代谢酶的影响，药物原型或代谢物经过血液循环迅速分布在各组织。肾脏作为人体的重要排泄器官，在药物的处置中发挥重要作用。药物经肾脏的排泄过程包括肾小球滤过、肾小管分泌和重吸收三个过程，其中，转运体会参与肾小管分泌和重吸收过程。肾脏转运体在维持体内稳态中发挥重要作用，是外源物、代谢废物等体内清除的重要途径，是影响食物/药物-药物相互作用的重要因素，影响肾脏疾病的产生等等。人有机阴离子转运体I (hOATl)，是溶质转运体超家族(superfamily of Solute carriers, SLC)的成员，主要在近端肾小管上皮细胞基底侧表达，负责将药物或其代谢物从血液摄取到肾小管细胞。OATl底物谱比较广泛，内源性底物包括环核苷酸、叶酸、前列腺素等，外源性底物包括多种抗病毒药物(阿昔洛韦、西多福韦)、抗生素(青霉素、先锋霉素II)、多种利尿剂(布美他尼、利尿磺胺)以及非留体类抗炎药、甲氨蝶呤、赫曲霉素A等。
[0003]作为肾脏中主要的阴离子转运体，OATl在药物的代谢动力学、药物-药物相互作用以及药物的毒理学中发挥着重要作用。研究表明，同时服用青霉素G和OAT的抑制剂丙磺舒可明显延长前者的半衰期，敲除Oatl的小鼠分泌其经典底物对氨基马尿酸的能力显著降低；0AT1还可介导利尿剂、核酸类似物、抗病毒药物的药物-药物相互作用；0ΑΤ可介导内酰胺类抗生素和抗病毒药物的肾毒性，而服用OAT的抑制剂丙磺舒可降低西多福韦的潜在毒性，在过表达OAT的细胞系中，西多福韦的细胞毒性有较大升高。OATl可以介导多种中药成分在肾脏的转运，如黄酮类化合物、酚酸类化合物等。
`[0004]CYP1A2基因定位于人类第15号染色体上，包括7个外显子和6个内含子。CYP1A2是CYPlA家族中重要的药物代谢酶，占整个细胞色素Ρ450的13%-15%，主要分布在肝脏中，另外在肠道，脑，肺中也有少量CYP1A2分布。CYP1A2参与多种药物在体内的生物转化以及一些环境毒素的代谢和致癌物质的激活过程。目前已知CYPlA参与咖啡因、华法林、茶碱、普萘洛尔、美西律、维拉帕尔、硝苯地平、他克林等几十种药物的代谢过程。
[0005]目前关于药物转运体和代谢酶的协同作用还缺乏全面的了解，可用于该方向研究的体外模型较少。
【发明内容】
[0006]本发明的一个目的是提供一种共表达摄取转运体和药物代谢酶模型的构建方法，涉及的是共表达人OATl和CYP1A2细胞模型的构建方法，通过以下步骤实现:
(I)先以人基因例/7 cDNA为模板，通过设计含及^7? I和I双酶切位点的特定引物SEQ ID No:3和SEQ ID No:4，扩增得到人OATl基因片段NM_004790，其核苷酸序列如SEQ ID如:1所示，经过双酶切的？0?产物和载体？00嫩3.1(+)片段，通过T4连接酶连接，构建质粒pcDNA3.1 (+) /OATl，转化大肠杆菌进行质粒扩增，测序；测序正确后，转染MDCK细胞(ATCC)，经过氨基糖苷类抗生素G418筛选出单克隆细胞，得到稳定高表达OATl的MDCK细胞。(2)然后先从冰冻人肝组织中提取总RNA，经逆转录获得人的cDNA文库，以该cDNA为模板，通过设计含有及丽7 I和I两个酶切位点的特定引物SEQ ID No:5和SEQ ID如:6，扩增得到人0￥卩认2基因片段匪_000761，其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。(3)经过双酶切的PCR产物和带有潮霉素B筛选标记的载体pcDNA3.1/Hygro (+)片段，通过T4连接酶连接，构建质粒pcDNA3.1/Hygro (+)/CYPlA2,转化大肠杆菌进行质粒扩增,测序。(4)测序正确后，转染MDCK-hOATl细胞，经过潮霉素B筛选，得到共表达OATl和CYP1A2细胞，进行mRNA验证并通过经典底物对氨基马尿酸及抑制剂丙磺舒进行OATl的功能验证以及通过经典底物非那西丁进行CYP1A2的功能验证。
[0007]本发明的另一个目的是提供所述共表达OATl和CYP1A2的细胞模型在OATl和CYP1A2底物或抑制剂初步筛选中的应用，或者考察两者在介导药物的细胞毒性中的作用。
[0008]通过以下步骤实现:加入50umol/L待测药物，孵育48h，置于倒置荧光显微镜下观察细胞形态和数目变化，将细胞用PBS缓冲液洗两次，加入甲醇固定15min。加入0.5 μ mol/L DAPI染色液室温避光作用15min。将染色后的细胞置于倒置荧光显微镜下观察细胞核的形态和数量变化，加入0.5mg/mL MTT继续孵育4h，加入200 μ L DMSO孵育lOmin，于酶标仪570nm处读取吸光度值。吸光度值越小，细胞成活量越低，表明待测药物毒性越大。
[0009]本发明提供一种共表达细胞模型，具有稳定高表达人OATl和CYP1A2两种蛋白的优势，可以作为基于OATl和CYP1A2的药物毒性作用在细胞水平上的毒性筛选模型，以及研究OATl和CYP1A2在药物处置中的协同作用。
[0010]本发明的积极效 果是:
(I)而本发明构建的MDCK-hOATl/CYPIA2细胞共转染转运蛋白与代谢酶，可以在体外同时研究两者在药物处置中的作用。本发明建立的细胞模型可以作为OATl和CYP1A2的底物的筛选模型，预测药物在体内的转运和代谢情况。
[0011](2)越来越多的报道中药具有肾毒性，因此,中药肾毒性的快速有效筛选已成为中药研究开发和临床应用的障碍。中药肾毒性早期快速，有效地筛选尤为重要。本发明提供的细胞模型可以预测中药成分的毒性情况。
[0012](3)目前临床上多采用联合用药方式治疗，合用不同药物可能会引起不良反应，本发明提供的细胞模型可以用来研究基于hOATl和CYP1A2的药物-药物相互作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1A质粒pcDNA3.1(+)/0ΑΤ1经及I和觔e I双酶切鉴定电泳图。条带Marker为 Marker DL15000,条带 1,2 分别为质粒 pcDNA3.1 (+)，pcDNA3.1 (+) /OATl 备EcoR I 和Nhe I双酶切电泳图。
[0014]图1B 质粒 pcDNA3.1/Hygro (+) /CYPIA2 HBamH I 和船e I 双酶切鉴定电泳图。条带 Marker 为 Marker III,条带 I, 2 分别为质粒 pcDNA3.1/Hygro (+),pcDNA3.1/Hygro (+)/CYPIA2经Nhe I和BatnH I双酶切电泳图。[0015]图2 OATl在MDCK-0AT1细胞中的转录水平。图中数据以mean±SD表示，n=3。Mock为转染空载体细胞，D3和F8分别为转染OATl的单克隆细胞。
[0016]图3在有或无抑制剂丙磺舒(lmmol/L)作用下，6-CFL (4Mmol/L)在MDCK-0AT1细胞中的积聚。图中数据以mean±SD表示，n=4。Mock为转染空载体细胞，D3和F8分别为转染OATl的单克隆细胞。
[0017]图4在有或无抑制剂丙磺舒(lmmol/L)作用下，对氨基马尿酸(5Mmol/L)在MDCK-0AT1细胞中的积聚。图中数据以mean±SD表示，n=3。Mock为转染空载体细胞，D3和F8分别为转染OATl的单克隆细胞。
[0018]图5是不同中药成分对MDCK-0AT1细胞积聚6-CFL的抑制作用。
[0019]图6是CYP1A2在Mock和MDCK- CYP1A2两种细胞中的转录水平。图中数据以mean±SD表示，n=4。Mock为转染空载体细胞，2和6分别为转染CYP1A2的单克隆细胞。
[0020]图7是在有或无抑制剂α-萘黄酮(lMmol/L)作用下，荧光底物Luciferin-1A2(6Mmol/L)在Mock和MDCK-CYP1A2两种细胞中的代谢。图中数据以mean±SD表示，n=4。Mock为转染空载体细胞，2和6均为转染CYP1A2的单克隆细胞。
[0021]图8是非那西丁(50 μ mol/L)在Mock和MDCK- hOATl/ CYP1A2两种细胞中的代谢。图中数据以mean±SD表示，n=4。Mock为转染空载体细胞，MDCK-0AT1/CYP1A2为共表达OATl和CYP1A2的单克隆细胞。
[0022]图9是通过MTT实验检测不同马兜铃酸浓度对Mock、MDCK-0ATl和MDCK- hOATl/CYP1A2细胞的毒性。图 中数据以mean±SD表示，n=5。25，50分别为马兜铃酸I (AAI)的浓度，单位为μ mol/L。
[0023]图10对照组(0.5%DMS0)和实验组(50 μ mol/L马兜铃酸和0.5%DMS0)对Mock、MDCK-OATI和MDCK- hOATl/ CYP1A2细胞作用48h后细胞数目和形态的变化。马兜铃酸母液由DMSO配制，稀释到50 μ mol/L浓度时DMSO含量为0.5%。
[0024]图11是对照组(0.5%DMS0)和实验组(50 μ mol/L马兜铃酸和0.5%DMS0)处理过的Mock、MDCK_0ATl和MDCK- hOATl/ CYP1A2细胞经DAPI染色后细胞核数目和形态的变化。
【具体实施方式】
[0025]本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
[0026]实施例1
重组质粒 pcDNA3.1 (+) /OATl 及 pcDNA3.1/Hygro (+) /CYP1A2 的构建
1.1重组质粒pcDNA3.1 (+) /OATl的构建
(I)根据人OATl的DNA序列设计两条PCR引物。上下游引物分别设计一个酶切位点，EcoR I和觔e I (下划线标出)
上游引物:5’ - CTAGCTAGCGACATGGCCTTTAATGACCTCCTGCAG -3’ ；
下游引物:5’ - CAGGAATTCTCAGAGTCCATTCTTCTCTTGTGCTGA -3’。
[0027](2)以pCMV6-0ATl质粒为模版进行PCR，反应体系和反应条件见表1。
【权利要求】
1.一种共表达摄取转运体和药物代谢酶细胞模型的构建方法，其特征在于，通过以下步骤实现: (1)以人基因OATlCDNA为模板，通过设计含EcoR I和Nhel双酶切位点的特定引物SEQ ID No:3和SEQ ID No:4，扩增得到人OATl基因片段NM_004790，其核苷酸序列如SEQID No:1所示，经过双酶切的PCR产物和载体pcDNA3.1 (+)片段，通过T4连接酶连接，构建质粒pcDNA3.1 (+) /OATl，转化大肠杆菌进行质粒扩增，测序；测序正确后，转染MDCK细胞，经过氨基糖苷类抗生素G418筛选出单克隆细胞，得到稳定高表达OATl的MDCK细胞； (2)然后从冰冻人肝组织中提取总RNA，经逆转录获得人的cDNA文库，以该cDNA为模板，通过设计含有及丽7 I和I两个酶切位点的特定引物SEQ ID No:5和SEQ ID No:6,扩增得到人CYP1A2基因片段NM_000761，其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示； (3)经过双酶切的PCR产物和带有潮霉素B筛选标记的载体pcDNA3.1/Hygro (+)片段，通过T4连接酶连接,构建质粒pcDNA3.1/Hygro (+) /CYP1A2,转化大肠杆菌进行质粒扩增，测序； (4)测序正确后，转染MDCK-hOATl细胞，经过潮霉素B筛选，得到共表达OATl和CYP1A2细胞，进行mRNA验证并通过经典底物对氨基马尿酸及抑制剂丙磺舒进行OATl的功能验证以及通过经典底物非那西丁进行CYP1A2的功能验证。
2.根据权利要求1所述的一种共表达摄取转运体和药物代谢酶细胞模型的构建方法在OATl和CYP1A2底物或抑制剂初步筛选中的应用。
3.根据权利要求1所述的一种共表达摄取转运体和药物代谢酶细胞模型的构建方法在考察OATl和CYP1A2底物或抑制剂在介导药物的细胞毒性中的作用。
4.根据权利要求2或3 所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现:加入一定浓度的待测药物，孵育一定时间，置于倒置荧光显微镜下观察细胞形态和数目变化，将细胞用PBS缓冲液洗两次，加入甲醇固定15min，加入0.5μπι01/1 DAPI染色液室温避光作用15min，将染色后的细胞置于倒置荧光显微镜下观察细胞核的形态和数量变化，加入0.5mg/mL MTT继续孵育4h，加入200 μ L DMSO孵育lOmin，于酶标仪570nm处读取吸光度值，吸光度值越小，细胞成活量越低，表明待测 药物毒性越大。
【文档编号】C12N5/10GK103881977SQ201410066266
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年2月26日 优先权日:2014年2月26日
【发明者】曾苏, 赵垒, 胡海红, 余露山, 蒋惠娣, 周惠, 徐思云 申请人:浙江大学