专利名称：红细胞富集与rt－pcr联合检测禽流感病毒方法
技术领域：
本发明公开了一种鉴定病毒，特别是鉴定禽流感H5、H9亚型病毒的检测方法。
背景技术：
禽流感(Avian Influenza)是一种重要的人兽共患病，其病原为禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)，目前危害性最大的禽流感病毒主要是H5、H7和H9亚型。由于该病危害性大，发病急，因此，对该病的快速诊断具有重要的现实意义。目前RT-PCR方法是禽流感主要快速检测方法之一(如中国专利ZL200410014289.9禽流感病毒多重PCR检测方法)，该方法提供了一种快速、特异的检测禽流感病毒并鉴定其亚型的方法。如何进一步提高RT-PCR方法检测禽流感病毒的灵敏性，提高其在实际临床样品中的检出率，是该方法能否应用于临床的关键环节之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种红细胞富集与RT-PCR联合检测禽流感病毒方法，提高RT-PCR方法对禽流感临床样品的检出率。
本发明先采用浓度为1％的红细胞凝集、解凝集，得到富集的禽流感病毒，然后用Trizol kit提取样本基因RNA，再进行反转录合成cDNA，然后进行一次性PCR扩增特定的多个基因，最后电泳鉴定。
本发明根据禽流感病毒能够凝集红细胞，并且可以在一定条件下从红细胞上脱离下来的特点，建立了红细胞富集临床样品中禽流感病毒的方法，该方法联合多重RT-PCR检测临床样品，提高快速检测方法对禽流感临床样品检出率，进一步完善了RT-PCR方法在禽流感临床检测中的应用。本发明较常规的禽流感病毒富集方法简单、快速，尤其是对少量禽流感病毒的富集。
本发明所述凝集、解凝集方法是将样本与浓度为1％的红细胞混合，在4℃环境条件下，静置40min～50min后，于4℃、2000rpm离心5min，弃去上清，加入PBS，缓慢悬浮红细胞，将收集的悬浮红细胞于37℃水浴30min～40min后，2000rpm离心5min，收集上清，即为富集的禽流感病毒样品。
具体实施例方式
步骤1鸡红细胞的制备于10mL注射器中先吸入约3mL抗凝剂(3.8％柠檬酸三钠)，从健康鸡翅静脉或心脏采血，用生理盐水洗涤3次，前2次1500rpm离心5min，最后1次同速度离心10min，弃上清，用无菌生理盐水配成1％悬液，置4℃待用。
步骤2鸡红细胞富集禽流感病毒方法富集方法程序如下10mL待测样品上清中加入1mL 1％的鸡红细胞，静置于4℃环境温度下40min～50min后，2000rpm、4℃离心5min，弃去上清，再加入200μL PBS，缓慢悬浮红细胞，取出悬浮红细胞于37℃水浴30min～40min后，2000rpm离心5min，上清即为富集的禽流感病毒样品。
通过该方法可以将样品富集约50倍。
步骤3PBS缓冲液的配方(1L)NaCl 8.0gKCl0.2gKH2PO40.2gNa2HPO4·12H2O 2.9g调pH至7.2～7.4，121℃，20min高压灭菌，冷却后4℃保存备用。
步骤4鸡红细胞富集禽流感病毒方法与RT-PCR方法的联合应用将单独RT-PCR与RT-PCR联合红细胞富集方法应用于78份临床确诊组织样品的检测，同时进行鸡胚病毒分离对照，比较其检测结果。每一份样品的具体操作过程如下取两份5g临床确诊禽流感的禽类(鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸵鸟等)组织(肝脏、脾脏)样品，剪碎后充分研磨，一份加入适量PBS，反复冻融3次，8000rpm，4℃离心10min，收获上清，直接应用RT-PCR检测；另一份加入10mL PBS，按照实施例2中所述方法经红细胞富集后再应用RT-PCR检测。RT-PCR方法参见专利号ZL200410014289.9发明专利禽流感病毒多重PCR检测方法。
下表为三种检测方法检测临床样品结果比较
试验结果显示，单独应用RT-PCR方法检测78份临床确诊样品，AIV检出率为44.9％；而应用红细胞富集与RT-PCR联合检测上述临床样品，AIV检出率显著提高，而且与鸡胚分离结果的符合率为100％。红细胞富集AIV方法显著提高了RT-PCR对临床样品的检出率。
以上实施例表明发明人成功建立了红细胞富集AIV的方法，经验证红细胞富集方法能显著提高RT-PCR方法对禽流感病毒H5、H9亚型临床样品的检出率。
权利要求
1.红细胞富集与RT-PCR联合检测禽流感病毒方法，用Trizol kit提取样本基因RNA，再进行反转录合成cDNA，然后进行一次性PCR扩增特定的多个基因，最后电泳鉴定，其特征在于在用Trizol kit提取样本基因RNA前，先采用浓度为1％的红细胞凝集、解凝集，得到富集的禽流感病毒。
2.根据权利要求1所述红细胞富集与RT-PCR联合检测禽流感病毒方法，其特征在于所述凝集、解凝集方法是将样本与浓度为1％的红细胞混合，在4℃环境条件下，静置40min～50min后，于4℃、2000rpm离心5min，弃去上清，加入PBS，缓慢悬浮红细胞，将收集的悬浮红细胞于37℃水浴30min～40min后，2000rpm离心5min，收集上清，即为富集的禽流感病毒样品。
全文摘要
红细胞富集与RT－PCR联合检测禽流感病毒方法，本发明公开了一种鉴定病毒，特别是鉴定禽流感H5、H9亚型病毒的检测方法。先采用浓度为1％的红细胞凝集、解凝集，得到富集的禽流感病毒，然后用Trizol kit提取样本基因RNA，再进行反转录合成cDNA，然后进行一次性PCR扩增特定的多个基因，最后电泳鉴定。该方法联合多重RT－PCR检测临床样品，提高快速检测方法对禽流感临床样品检出率，进一步完善了RT－PCR方法在禽流感临床检测中的应用。本发明较常规的禽流感病毒富集方法简单、快速，尤其是对少量禽流感病毒的富集。
文档编号C12Q1/70GK1932042SQ20061004148
公开日2007年3月21日 申请日期2006年9月8日 优先权日2006年9月8日
发明者焦新安, 曾显营, 耿士忠, 潘志明, 黄金林, 孙林, 殷月兰, 刘秀梵 申请人:扬州大学