一种禽流感h9亚型灭活疫苗及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种禽流感H9亚型灭活疫苗，由2株H9亚型禽流感病毒经灭活后和油佐剂混合组成，2株H9亚型禽流感病毒分别为HZ株和FJ株，HZ株的HA基因序列如SEQ?ID?NO:1所示，FJ株的HA基因序列如SEQ?ID?NO:2所示。其通过制备H9亚型禽流感病毒HZ株毒液和FJ株毒液，灭活H9亚型禽流感病毒HZ株毒液和FJ株毒液，制备油相溶液，制备水相溶液以及乳化制得。本发明利用2株不同地方分离的H9亚型禽流感毒株制备一种免疫原性强、交叉保护性好的灭活疫苗，能够应用于预防鸡H9亚型禽流感疾病中。该疫苗接种鸡后，抗体效价高，使得鸡对不同地方流行的H9亚型毒株攻毒保护力好，并且安全性高、效力稳定。
【专利说明】一种禽流感H9亚型灭活疫苗及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于动物用生物制品【技术领域】，具体涉及一种禽流感H9亚型灭活疫苗及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]禽流感(Avian Influenza，Al)，是由流感病毒属的A型流感病毒引起的禽类感染和疾病的总称。鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染，而对家养的鸡和火鸡引起的危害最为严重，候鸟、观赏鸟、散禽携带病毒迁徙可能是禽流感世界性流行的主要原因，猪等也可作为“混合器”传播本病。
[0003]根据禽流感病毒AIV对禽类致病性的差异，可将AIV分为高致病性禽流感病毒(HPAIV)和低致病性禽流感病毒(LPAIV)。H9亚型禽流感属于低致病性流感病毒，是目前我国鸡群中存在的AIV主要亚型，该病毒发病后虽然致死率不高(一般不超过30%)，但常导致呼吸道症状，蛋鸡的产蛋下降，并使鸡群易继发严重的呼吸道疾病，影响家禽生产性能。目前其流行特点是:H9亚型仍是当前流行的主要亚型；H9亚型已发生变异；H9亚型成散发或地方性流行；H9亚型呈现出条件性致病的特性；H9亚型对肉仔鸡危害日益严重。
[0004]AIV遗传变异极为频繁，血清亚型众多。研究发现，AIV可通过基于的点突变、基因重组和节段重排而发生不同程度的变异，从而使流感病毒的抗原性和致病性发生改变。AIV的变异主要发生在HA和NA基因上，尤其是HA基因，其分子机理主要有:抗原漂移、抗原转变、RNA重组和缺损性病毒颗粒的产生等。近些年，随着反向遗传学的发展，禽流感遗传变异和其机制逐步得到证实。就H5亚型而言，根据当前H5亚型的变异情况，采用反向遗传技术获得了 Rec-l、Rec-4、Rec-5和Rec_6疫苗株，在高致病性禽流感的防控方面取得了一定的成绩。关于H9亚型的变异研究也一直在进行中。刘岩对1998-2002年间分离的H9亚型禽流感病毒的抗原性变异进行了研究，经交叉HI试验、鸡胚中和试验、细胞中和试验、交叉攻毒保护试验及HA基因分析，证明了 H9亚型禽流感病毒已经发生了抗原性漂移。而姜北宇等人的研究则表明，1998-2008年在北京及河北省分离的4株H9亚型禽流感流行毒株间大多产生了较好的交叉保护力，用1998-2006年分离的流行毒株制备的灭活疫苗能够保护2008年流行毒株的攻击。可见，对于H9亚型禽流感病毒流行毒株抗原性是否发生变异的问题，不同报道得出的试验结论存在较大的差异。
[0005]疫苗免疫仍是目前防控H9亚型禽流感有效办法之一。随着H9亚型禽流感灭活疫苗单苗或者联苗的广泛应用，近些年来，在免疫压力的作用下，开始出现以前使用的疫苗毒株对现地分离毒株的免疫保护力下降，许多养殖单位根据自身免疫需要纷纷采用现地流行毒株制成灭活疫苗来防控H9亚型禽流感的发生，但这些疫苗不能正规生产、销售和大面积推广，并且不能保证其安全性。因此，针对疫病现在的流行特点，重新筛选安全、有效、稳定的禽流感H9亚型病毒株制备H9亚型灭活疫苗显得非常必要。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用2株不同地方分离的H9亚型禽流感毒株制备成一种免疫原性强、交叉保护性好的灭活疫苗，用于预防鸡H9亚型
禽流感。
[0007]为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下: [0008]一种禽流感H9亚型灭活疫苗，由2株H9亚型禽流感病毒经灭活后和油佐剂混合组成，2株H9亚型禽流感病毒分别为HZ株和FJ株，其保藏登记号分别为CGMCC N0.8355和CGMCC N0.8354 ；HZ株的HA基因序列如SEQ ID NO:1所示，FJ株的HA基因序列如SEQ IDNO: 2所示。HZ株和FJ株于2013年10月15日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该中心于2013年10月18日收到上述保藏菌株，保藏日期为2013年10月18日，该中心地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编100101。
[0009]一种禽流感H9亚型灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤:
[0010]I)制备H9亚型禽流感病毒HZ株毒液:将H9亚型禽流感病毒HZ株用生理盐水作10_4稀释，接种9~11日龄SPF鸡胚，无菌收获24~96小时内死亡及96小时后仍存活的HA ^ 81og2的鸡胚尿囊液作为H9亚型禽流感病毒HZ株毒液；
[0011]2)制备H9亚型禽流感病毒FJ株毒液:将H9亚型禽流感病毒FJ株用生理盐水作10_4稀释，接种9~11日龄SPF鸡胚，无菌收获24~96小时内死亡及96小时后仍存活的HA ^ 81og2的鸡胚尿囊液作为H9亚型禽流感病毒FJ株毒液；
[0012]3)灭活H9亚型禽流感病毒HZ株毒液:在HZ株毒液中加入终浓度为0.2%甲醛溶液，37 °C摇床灭活24小时；
[0013]4)灭活H9亚型禽流感病毒FJ株毒液:在FJ株毒液中加入终浓度为0.1%甲醛溶液，37 °C摇床灭活24小时；
[0014]5)制备油相溶液:将白油和司本-80按照体积比为18~20:1混合均匀，加热溶解后经121°C灭菌20分钟；
[0015]6)制备水相溶液:将灭活的HZ株毒液和灭活的FJ株毒液按照体积比为6:4混合均匀，加入占混合毒液体积比0.75%的高压灭菌的吐温-80，用磁力搅拌器混匀搅拌至吐温完全溶解；
[0016]7)乳化:将油相溶液和水相溶液按照体积比为I~2:1混合均匀，在乳化搅拌机中搅拌，即制成所述禽流感H9亚型灭活疫苗。
[0017]作为本发明的进一步技术方案，步骤5)中的白油和司本-80按照体积比为18.5:1混合。
[0018]作为本发明的进一步技术方案，步骤7)中的油相溶液和水相溶液按照体积比为
1.5:1混合。
[0019]一种禽流感H9亚型灭活疫苗在预防鸡禽流感疾病中的应用。
[0020]相比现有技术，本发明的有益效果在于:利用2株不同地方分离的H9亚型禽流感毒株制备成一种免疫原性强、交叉保护性好的灭活疫苗，用于预防鸡H9亚型禽流感。该疫苗接种鸡后，抗体效价高，使得鸡对不同地方流行的H9亚型毒株攻毒保护力好，并且安全性高、效力稳定。
[0021]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为黄鸡免疫HZ-FJ株灭活疫苗后的禽流感H9亚型血清抗体水平变化；
[0023]图2为竹丝鸡免疫HZ-FJ株灭活疫苗后禽流感H9亚型血清抗体水平变化。
【具体实施方式】
[0024]实施例1:H9亚型禽流感病毒HZ株和FJ株的生物学特性研究
[0025]本发明所述的H9亚型禽流感病毒HZ株和FJ株分别是2010年在我国浙江湖州地区和福建莆田地区发病鸡场的发病鸡群采集的病料中分离到的，经测序鉴定，都为禽流感病毒H9亚型。其生物学特性研究如下:1)毒种传代:HZ株、FJ株原代种毒(El代)用灭菌生理盐水稀释至10_4，经尿囊腔内接种9日龄SPF鸡胚，每胚0.2mL,于37°C继续孵育96小时，收获24~96小时内死亡及存活的鸡胚，冻存过夜后逐个收获鸡胚液并检测其HA效价，将检验无菌且HA效价> 81og2的鸡胚液混合，定量分装，注明收获日期、毒种代次等，标记为E2代，留取少量继续传代，其余的置_70°C保存备用。按上述方法连续在SPF鸡胚内传代至第8代(ES代)，每一代分别测定各胚的HA效价及其平均数，结果详见表1。
[0026]表1毒株El~E8代的HA效价
[0027]
【权利要求】
1.一种禽流感H9亚型灭活疫苗，其特征在于:由2株H9亚型禽流感病毒经灭活后和油佐剂混合组成，2株H9亚型禽流感病毒分别为HZ株和FJ株，其保藏登记号分别为CGMCC:8355和CGMCC:8354,HZ株的HA基因序列如SEQ ID NO:1所示，FJ株的HA基因序列如SEQID NO:2 所示。
2.—种权利要求1所述的禽流感H9亚型灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤: 1)制备H9亚型禽流感病毒HZ株毒液:将H9亚型禽流感病毒HZ株用生理盐水作10_4稀释，接种9~11日龄SPF鸡胚，无菌收获24~96小时内死亡及96小时后仍存活的HA≥81og2的鸡胚尿囊液作为H9亚型禽流感病毒HZ株毒液； 2)制备H9亚型禽流感病毒FJ株毒液:将H9亚型禽流感病毒FJ株用生理盐水作10_4稀释，接种扩11日龄SPF鸡胚，无菌收获24、6小时内死亡及96小时后仍存活的HA >8log2的鸡胚尿囊液作为H9亚型禽流感病毒FJ株毒液； 3)灭活H9亚型禽流感病毒HZ株毒液:在HZ株毒液中加入终浓度为0.2%甲醛溶液，37 °C摇床灭活24小时； 4)灭活H9亚型禽流感病毒FJ株毒液:在FJ株毒液中加入终浓度为0.1%甲醛溶液，37 °C摇床灭活24小时； 5)制备油相溶液:将白油和司本-80按照体积比为If20:1混合均匀，加热溶解后经121°C灭菌20分钟； 6)制备水相溶液:将灭活的HZ株毒液和灭活的FJ株毒液按照体积比为6:4混合均匀，加入占混合毒液体积比0.75%的高压灭菌的吐温-80，用磁力搅拌器混匀搅拌至吐温完全溶解； 7)乳化:将油相溶液和水相溶液按照体积比为广2:1混合均匀，在乳化搅拌机中搅拌，即制成所述禽流感H9亚型灭活疫苗。
3.根据权利要求2所述的一种禽流感H9亚型灭活疫苗的制备方法，其特征在于:步骤5)中的白油和司本-80按照体积比为18.5:1混合。
4.根据权利要求2所述的一种禽流感H9亚型灭活疫苗的制备方法，其特征在于:步骤7)中的油相溶液和水相溶液按照体积比为1.5:1混合。
5.一种禽流感H9亚型灭活疫苗在预防鸡禽流感疾病中的应用。
【文档编号】C12R1/93GK103736088SQ201310553960
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】陈瑞爱, 林绮萍, 陈春丽, 黄文科, 徐家华, 严洁珍 申请人:广东大华农动物保健品股份有限公司, 肇庆大华农生物药品有限公司