免疫球蛋白融合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明公开包括生物活性分子和连接到生物活性分子的免疫球蛋白(Ig)Fc结构域的融合蛋白。该Fc结构域是(i)IgG1、IgG2或IgG4，或(ii)IgG4和IgD的杂交人Fc结构域。该杂交Fc用作生物活性分子的载体。
【专利说明】免疫球蛋白融合蛋白
本申请是申请日为2008年5月30日、申请号为200880016313.9、题为“免疫球蛋白融合蛋白”的专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0001]本发明涉及杂交人Fe和免疫球蛋白融合蛋白，在其中杂交人Fe连接到生物活性分子。具体地，它涉及杂交人Fe，其源于人免疫球蛋白G(IgG)亚类的组合或人IgD和IgG的组合；以及融合蛋白，在其中这种Fe经共价键偶联到生物活性分子。
[0002]
【背景技术】
[0003]生物活性分子在治疗上可以具有很大的优势。但是，它们作为治疗剂可能具有缺点，因为它们具有较低的体内稳定性。它们具有较短的循环半衰期或血清半衰期，因为它们被活体内各种酶消化。因此，一直期望提高生物活性分子的循环半衰期。
[0004]已知:增加蛋白质大小，通过阻止经肾去除蛋白质可以增加它的半衰期(Knauf等，J.Biol.Chem.1988.263 =15064-15070)。例如，已经报道通过将活性蛋白偶联到人白蛋白可增加蛋白质稳定性(Kinstler等,Pharm.Res.1995.12:1883-1888)。但是，由于活性蛋白至人白蛋白的偶联只是略微增加它的滞留期，因此发展含有偶联到人白蛋白的活性蛋白的有效药物制剂不是有效方法。
[0005]其它报道的方法是调整蛋白质的糖基化。在蛋白质上增加糖基化和将唾液酸引入蛋白质可防止肝中蛋白质的降解。但是，蛋白质糖基化的增加也导致了蛋白质活性的降低。
[0006]为了稳定蛋白质和防止经肾的清除，将蛋白质连接到聚乙二醇(PEG)。共价连接到PEG已经被广泛使用以递送具有延长的半衰期的药物(Delgado等，1992.9 =249-304)。但是，已经报道PEG连接到细胞因子或激素导致受体结合亲和力的降低，原因在于该连接所引起的位阻。
[0007]最近，已经研究和发展了使用免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)制备的融合蛋白。Ig是血液的主要成分。A Ig (human Ig’hlg)包括不同种类,例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE (Roitt 等，“Immunology，，1989, Gower Medical Publishing, London, U.K.；New York,N.Y)。人IgGs可以进一步分为各种亚型，其已知为人IgGl (hlgGl)、人IgG2 (hIgG2)、人IgG3 (hIgG3)和人 IgG4 (hIgG4)。
[0008]免疫球蛋白由四条多肽链组成，两条重链和两条轻链，它们经过二硫键形成四聚体。每条链由可变区和恒定区组成。基于同种型(isotypes)，重链的恒定区进一步地分成三个或四个区(CH1、CH2、CH3和CH4)。基于Ig同种型，重链恒定区的Fe部分包括铰合部、CH2、CH3和/或CH4结构域。
[0009]关于血清半衰期，IgGl、IgG2和IgG4具有21天的长半衰期，而其它免疫球蛋白具有小于一周的相对短的半衰期。融合到IgG的Fe部分的嵌合蛋白质显示增加的稳定性和增加的血清半衰期(Capon等，Nature 1989.337:525-531)。生物活性蛋白已融合在CHl区域的N-端、Fe区域的N-端或IgG CH3区域的C-端。
[0010]在开始期，用细胞表面受体例如CD4(Capon等，Nature 1989.337:525-531)、TNFR (Mohler 等，J.1mmunology 1993.151:1548-1561)、CTLA4 (Linsley 等，J.Exp.Med.1991.173:721-730)、CD86 (Morton 等，J.1mmunology 1996.156:1047-1054)的胞外结构域产生IgG融合蛋白。同时，存在几种已融合到IgG结构域的细胞因子和生长激素。但是，与用细胞表面受体的胞外结构域的融合不同，与非融合细胞因子或生长因子相比，用可溶性蛋白质融合到IgG导致生物活性的降低。嵌合蛋白质作为二聚体存在，其导致由于与它们的靶分子类似受体的相互作用而的位阻，原因在于彼此靠得很近的两种活性蛋白质的存在。因此，这个问题应该被克服以产生有效的融合蛋白。
[0011]Fe融合技术的其它限制是存在不期望的免疫反应。免疫球蛋白的Fe结构域同时具有效应子功能例如抗体依赖的细胞介导细胞毒反应(antibody dependentcell-mediated cytotoxicity, ADCC)或补体依赖性细胞毒(complement-dependentcytotoxicity,⑶C)。这种效应子功能一般经过Ig的Fe区域与在效应细胞上FcRs的相互作用或经过补体结合取得。因此，应该进行Fe的效应子功能的阻断以减少不期望的反应例如细胞杀死、细胞因子释放或炎症。
[0012]发明公开 技术问题
[0013]总的说来，有对 具有生物活性的最小损失和具有不期望的免疫反应的最小风险的改良Fe融合蛋白的需求。
[0014]技术方案
[0015]本发明提供杂交Fe (杂合Fe)，其源于人IgG亚类的组合或人IgD和IgG的组合。当杂交Fe连接到生物活性分子时，杂交Fe有效增加了生物活性分子的血清半衰期，以及当编码Fe-多肽融合蛋白的核苷酸被表达时，增加了多肽的表达水平。
[0016]本发明同时提供在其中杂交Fe连接到生物活性分子的杂交Fe融合多肽。该融合蛋白有时称为“生物活性分子-Fe融合蛋白”或简称为“融合蛋白”。该融合蛋白可以具有Fe和生物活性分子之间的连接体。Fe可以在其N-端偶联到生物活性分子的C-端。
[0017]可通过如下步骤产生融合蛋白:构建编码和能够表达融合蛋白的核苷酸；在宿主细胞中表达它；和收获融合蛋白。可选地，该融合蛋白可以通过表达编码Fe的核苷酸，并以常规方式将它连接到生物活性分子而产生。
[0018]根据本发明的一种实施方式的多肽可以用下式表示:
[0019]N' -(Zl)p-Y-Z2-Z3-Z4-C/
[0020]其中N'是多妝的N-端和C'是多妝的C-端；
[0021]Zl表示氨基酸序列，其包括在SEQ ID NO: 11的90到98位置的氨基酸残基的至少C-端部分或在SEQ ID NO:14的90-98位置的氨基酸残基的至少一部分；
[0022]Y表示氨基酸序列，其包括在SEQ ID NO: 11的99到113位置的氨基酸残基的至少C-端部分或在SEQ ID NO:14的99到162位置的氨基酸残基的至少一部分；
[0023]Z2表示氨基酸序列，其包括在SEQ ID NO: 12的111到147位置的氨基酸残基的至少N-端部分或在SEQ ID NO:14的163到199位置的氨基酸残基的至少一部分；
[0024]Z3表示氨基酸序列，其包括在SEQ ID NO:11的118-223、SEQ ID N0:12的114-219,SEQ ID NO:24的165-270或SEQ ID NO:13的115到220位置的氨基酸残基的至少C-端部分；
[0025]Z4表示氨基酸序列，其包括在SEQ ID NO:11的224-330、SEQ ID NO: 12的220-326,SEQ ID NO:24的271-377或SEQ ID NO:13的221-327位置的氨基酸残基的至少N-端部分以及
[0026]P是O或I的整数，
[0027]其中Z2和Z3氨基酸残基总数是在80和140之间，两端数值包括在内。
[0028]Zl可以是氨基酸序列，其包括来自于SEQ ID NO:11的90_98位置的氨基酸残基C-端侧的5到9个连续氨基酸残基，或者来自于SEQ ID NO:14的90-98位置的氨基酸残基C-端侧的5-9个连续氨基酸残基。在一些实施方式中，Zl可以是IgGlCHl结构域(SEQID NO:11)或IgD CHl结构域(SEQ ID NO:14)的5、6、7、8或9个C-端氨基酸残基。
[0029]在另一个实施方式中，Zl是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:11的90_98位置的氨基酸残基或SEQ ID NO: 14的90-98位置的氨基酸残基。Zl可以是由SEQ ID N0:11的90-98的位置或SEQ ID NO:14的90-98的位置5到9个氨基酸残基组成的氨基酸序列。Zl也可以是由SEQ ID NO: 11的90到98氨基酸残基或SEQ ID NO:14的90到98的氨基酸残基组成的氨基酸序列。
[0030]Y可以是氨基酸序列，其包括来自于SEQ ID NO: 11的99到113位置的氨基酸残基的C-端侧的5个或更多个、或10个或更多个连续氨基酸残基，或来自于SEQ ID NO: 14的99到162位置的氨基酸残基C-端侧的10个或更多个连续氨基酸残基。在某些实施方式中，Y可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:11的99到113位置的氨基酸残基、SEQ IDNO:14的158到162位置的氨基酸残基、SEQ IDNO:14的153到162位置的氨基酸残基、SEQIDNO:14的143到162位置的氨基酸残基、SEQ ID NO:14的133到162位置的氨基酸残基或SEQ ID NO:14的99到162位置的氨基酸残基。
[0031]Z2可以是氨基酸序列，其包括来自于SEQ ID NO:12 (hIgG2)的111到147位置的氨基酸残基的N-端侧的4到37个或6-30个连续氨基酸残基，或来自于SEQ ID NO:14(hIgD)的163到199位置的氨基酸残基的N-端侧的6_30个连续氨基酸残基。在某些实施方式中，Z2可以是人IgG2CH2结构域的6个N-端氨基酸残基或人IgD CH2结构域的8
个N-端氨基酸残基。
[0032]Z2和Z3的氨基酸残基总数可以是80和140之间。在一个实施方式中，Z2和Z3的氨基酸残基总数可以是90和120之间，两端数值包括在内。在另一个实施方式中，Z2和Z3的氨基酸残基总数可以是105和115之间，两端数值包括在内。在一个实施方式中，Z2和Z3的氨基酸残基总数是108。在更一个实施方式中，Z2和Z3的氨基酸残基总数是109。
[0033]Z4可以是氨基酸序列，其包括来自于SEQ ID NO:11 (hlgGl)的224-330、SEQ IDNO:12(hIgG2)的 220-326、SEQ ID NO:24(hIgG3)的 271-377 或 SEQ ID NO:13(hIgG4)的221到327位置的氨基酸残基的90或更多个、或100或更多个连续氨基酸残基。Z4可以是SEQ ID NO:11 的 224-330、SEQ ID NO:12 的 220_326、SEQ ID NO:24 的 271-377 或 SEQ IDNO: 13的221到327位置的氨基酸残基的氨基酸序列。
[0034]根据实施方式，Z3-Z4是选自以下的氨基酸序列:⑴由SEQ ID NO: 11的118到223位置的氨基酸残基的C-端部分和SEQ ID NO:11的224到330位置的氨基酸残基的N-端部分组成的连续氨基酸序列，(ii)由SEQ ID NO:12的114到219位置的氨基酸残基的C-端部分和SEQ ID NO: 12的220到326位置的氨基酸残基的N-端部分组成的连续氨基酸序列，(iii)由SEQ ID NO:24的165到270位置的氨基酸残基的C-端部分和SEQ IDNO:24的271到377位置的氨基酸残基的N-端部分组成的连续氨基酸序列，和(iv)由SEQID NO: 13的115到220位置的氨基酸残基的C-端部分和SEQ ID NO: 13的221到327位置的氨基酸残基的N-端部分组成的连续氨基酸序列。
[0035]根据本发明的一个实施方式，多肽的氨基酸残基总数是从154到288。
[0036]在一个实施方式中，Y可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:11的99-113位置的氨基酸残基的至少一部分，P可以是O或I ;Z2可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID N0:12的111-147位置的氨基酸残基的至少一部分；和Z3可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:11的 118-223、SEQ ID NO:12 的 114-219、SEQ IDNO:24 的 165-270 或 SEQ ID NO:13 的 115到220位置的氨基酸残基的至少一部分。在这个实施方式中，当P是I时，Zl可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:11的90到98位置的氨基酸残基的至少一部分。
[0037]在进一步的实施方式中，Z3可以是SEQ ID NO:11的118-223、SEQID NO:12的
114-219,SEQ ID NO:24 的 165-270 或 SEQ ID NO:13 的 115-220 位置的 73 到 106 个连续氨基酸残基，并且Z2和Z3的氨基酸残基总数可以是110。Z2可以是SEQ ID NO: 12的111-116位置的氨基酸残基，和Z3可以是SEQ ID NO:11的120-223、SEQ ID NO:12的116_219、SEQID NO:24的167-270或SEQ ID NO:13的118到220位置的氨基酸序列。
[0038]在另一个实施方式中，Y可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO: 14的99到162位置的氨基酸残基的至少一部分，P可以是I或0(零)；Z2可以是氨基酸序列，其包括SEQ IDNO:14的163-199位置的氨基酸残基的至少一部分；和Z3可以是氨基酸序列，其包括SEQID NO:13的121到220位置的氨基酸残基的至少一部分。在这个实施方式中，当P是I时，Zl可以氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:14的90到98位置的氨基酸残基的至少一部分。
[0039]在进一步的实施方式中，Y可以是SEQ ID NO:14的99-162位置的氨基酸残基的C-端侧的20个连续氨基酸残基或更多个、30个连续氨基酸残基或更多个、40个连续氨基酸残基或更多个、50个连续氨基酸残基或更多个、或60个连续氨基酸残基或更多个。Z2可以是SEQ ID NO: 14的163到170位置的氨基酸残基，Z3可以包括SEQ ID NO:11的124-223、SEQ ID NO:12 的 120-219、SEQ ID NO:24 的 171-270 或 SEQ ID NO: 13 的 121-220 位置的氨基酸残基的C-端侧的71-100个连续氨基酸残基。Z2和Z3的氨基酸残基总数可以是108。
[0040]在一个实施方式中，多肽可以由选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:26 和 SEQ IDNO:27 的核苷酸序列编码。多肽是选自 SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28 和 SEQ ID NO:29 的氨基酸序列。
[0041]在一个实施方式中，多肽在它的N-端与生物活性分子融合，与所述生物活性分子的天然形式(native form)的循环半衰期比较,该生物活性分子显示增加的循环半衰期。该生物活性分子可以是多肽、蛋白质或非肽(apeptide)。该生物活性分子可以是多肽、肽或蛋白质药物。生物活性分子可以是可溶性蛋白质，例如但不限于:激素、细胞因子、生长因子、共刺激分子、激素受体、细胞因子受体、生长因子受体或短肽。该生物活性分子可以是EPO或它的变体/片段、p40或它的变体/片段(例如，含有Asn303Gln置换的p40变体)、G-CSF 或它的变体 / 片段、TNF 受体、GM-CSF、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-1O 受体、TGF-β 'TGF-β 受体、IL-17、IL-17 受体、因子 VI1、CXCL_11、FSH、人生长激素、骨形态生成蛋白-1 (bone morphogenetic protein-1, BMP-1)、CTLA4、Η)_1、GLP-1> β 动物纤维素(betacellulin)、OPG、RNAK、α 干扰素(interferon-alpha)、β 干扰素(interferon-beta)或它们的变体/片段。该生物活性分子可以是分泌性蛋白，其可以是成熟的形式。
[0042]在一个实施方式中，提供产生根据权利要求1的多肽的方法，其中该方法包括以下步骤:(i)将编码所述多肽的DNA分子引入哺乳动物宿主细胞，(ii)将细胞在其培养基中在所述多肽可以被表达的条件下生长；和(iii)收获表达的多肽。哺乳动物宿主细胞可以是CHO、COS或BHK细胞。
[0043]在另一个实施方式中，提供以下方法:(i)减少自身免疫性疾病的症状、预防或治疗自身免疫性疾病，(?)抑制移植排斥，或(iii)治疗或预防内毒素诱导的休克，其包括施用治疗有效量的以上所述多肽，其中该多肽融合到生物活性分子。
[0044]在一个实施方式中，提供分离的核酸分子，其编码根据本发明的实施方式的多肽。多肽可以具有选自以下的氨基酸序列:SEQ IDNO:18,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28 和 SEQ ID NO:29。核酸分子可以具有以下序列中显示的核苷酸序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:
4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:26 或 SEQ ID NO:27。核酸分子可以进一步地包括信号序列 或前导序列。
[0045]根据本发明的实施方式，提供包括所述核酸分子的表达载体和含有所述载体的宿主细胞。表达载体的例子包括但不限于pADllEP0-hFc-l、pADllG-CSF-hFc-l、pADllp40N303Q-hFc-l、pADllEPO-hFc-6、pADllG-CSF-hFc-6、pADllp40N303Q-hFc_6、pADllEP0-hFc-5、pADllG-CSF-hFc-5、pADllp40N303Q-hFc_5 和 pADllTNFR-hFc-5。
[0046]在一个实施方式中，提供向哺乳动物递送生物活性分子的方法，其包括向需要其的哺乳动物施用核酸分子的步骤。
[0047]在另一个实施方式中，多肽包括在N-端到C-端方向由铰链区、CH2结构域和CH3结构域组成的Fe结构域，其中所述铰链区包括人IgD铰链区或人IgGl铰链区的氨基酸残基的至少一部分；所述CH2结构域包括人IgG4CH2结构域的氨基酸残基的至少一部分，其中在人IgG4CH2结构域的N-端的4-37个连续氨基酸残基用人IgG2CH2结构域的N-端部分或人IgD CH2结构域的N-端部分的氨基酸残基的至少一部分置换，和所述CH3结构域包括人IgG4CH3结构域的氨基酸残基的至少一部分。
[0048]铰链区可以包括人IgGl的铰链区的氨基酸残基的至少一部分，所述CH2结构域包括人IgG4CH2结构域的氨基酸残基的至少一部分，其中在人IgG4CH2结构域的N-端的4_37个连续氨基酸残基用人IgG2CH2结构域的N-端区的氨基酸残基的至少一部分置换。
[0049]铰链区可以包括人IgD的铰链区的氨基酸残基的至少一部分，所述CH2结构域包括人IgG4CH2结构域的氨基酸残基的至少一部分，其中在人IgG4CH2结构域的N-端的4_37个连续氨基酸残基用人IgG2CH2结构域的N-端区的氨基酸残基的至少一部分置换。
[0050]多肽可以进一步包括CHl结构域，其中所述CHl结构域包括人IgGlCHl结构域的氨基酸残基的至少一部分，并且其中所述CHl结构域偶联到所述铰链区的N-端。多肽可以进一步包括CHl结构域，其中所述CHl结构域包括人IgDCHl结构域氨基酸残基的至少一部分，并且其中所述CHl结构域偶联到所述铰链区的N-端。多肽可以进一步包括偶联到所述铰链区的N-端的第二多肽，其中该第二多肽是生物活性的非免疫球蛋白多肽。多肽可以进一步包括通过连接体偶联到所述CHl结构域的N-端或偶联到所述CH4结构域C-端的生物活性分子，其中所述生物活性分子不是免疫球蛋白多肽。多肽和生物活性分子可以经连接体彼此连接。连接体分子是白蛋白连接体或合成的连接体。该白蛋白连接体包括SEQ IDNO:25 的 321 到 323,318 到 325,316 到 328,313 到 330,311 到 333 或 306 到 338 的氨基酸序列。该合成连接体可以是由Gly和Ser残基组成的10到20个氨基酸残基的肽。在一个实施方式中，这种 Gly-Ser 连接体是 GGGGSGGGGSGGGSG (SEQ ID NO:32)。
[0051]本发明也包括含有重组的Fe区的抗体分子，该重组的Fe区如上所述。
[0052]附图简述
[0053]图1显示杂交Fcs (hybrid Fcs,hFcs)的示意图，其可以用作以“X”表示的生物活性分子的载体蛋白。
[0054]图2 显示 hFcs 的图示，其中对源于 IgGl(SEQ ID NO:11)、IgG2 (SEQ ID:12)、IgG4(SEQ ID:13)和IgD(SEQ ID:14)的氨基酸位置进行详细描述。除非另有说明，本申请全部多肽中氨基酸位置的命名采用相同规则。
[0055]图3显示hFcs图示，其中通过以“AL”表示的白蛋白连接体，在C-端每个hFc偶联到以“X”表示的生物活性分子。
[0056]图4显示与连接体偶联的hFcs的图示，其中对源于人白蛋白(SEQ ID NO:25)的白蛋白连接体的氨基酸位置进行详细描述。
[0057]图5显示hFc-6的疏水性分布(hydrophobicity plot)的结果。
[0058]图6 (a)显示使用特异性 ELISA 分析的MabThera? (Rituximab)、hlgGl、I;nbrel?(etanercept)、EP0-hFc-5、G-CSF-hFc-5、p40N303Q-hFc_5 的 Fe y RI 结合活性结果；图 6 (b)显不使用特异性 ELISA 分析的MabThera? (Rituximab)、hlgGl、Enbrel? (etanercept)、EP0-hFc-5、G-CSF-hFc-5、p40N303Q-hFc-5 的 Clq 结合活性结果。
[0059]图7 (a)显示在人F36E细胞系中与EPO生物活性相比较的EPO-1gGlFc、EPO-hFc-1、EP0-hFc-5、EP0-hFc-6 和 Aranesp? (derbepoetin alfa)的生物活性结果；图7(b)显示在小鼠造血细胞系(NFS-6O)中 Neu丨asla? (pegfilgrastim)和 G-CSF-hFc-5 的体外生物活性结果；图7(c)显示在人PBMCs中p40和p40N303Q-hFc_5的体外生物活性结果；图7 (d)显示在鼠科L929细胞中Enbrel? (etanercept)和TNFR-hFc-5的体外生物活性结果；和图 7(e)显示在人 WISH 细胞中 thFc-l-AL(O)-1FN-β 和 thFc-1-AL(3)-1FN-β的体外生物活性结果。
[0060]图8(a)显示经SC途径(左图)和IV途径(右图)向猕猴施用的Aranesp?(derbepoetin alfa)、EPO-hFc-l或EP0_hFc_5的体内半衰期的结果；图8(b)显示经皮下注射途径(左图)和静脉注射途径(右图)向Sprague Dawley大鼠施用的LEUCOSTIM?(非格司亭)和G-CSF-hFc-Ι的药物动力学的结果；图8(c)显示经皮下注射途径向猕猴施用的Enbrel? (etanercept)的药物动力学的结果；图8((1)显示经皮下注射途径向SpragueDawley大鼠施用的TNFR-hFc-5和Enbrel? (etanercept)的药物动力学的结果。[0061]图9(a)显示经皮下注射途径(左上图)和静脉注射途径(右下图)向猕猴施用的Aranesp? (derbepoetin alfa)和EP0_hFc_5的体内生物活性的结果，图9 (b)显不经皮下
注射途径(上图)和静脉注射途径(下图)向Sprague Dawley大鼠施用的LKU(X)STlMfe(非格司亭)和G-CSF-hFc-Ι的体内生物活性的结果。
[0062]实现本发明的最佳方式
[0063]本发明提供杂交人免疫球蛋白Fe片段，其从N-端到C-端包括铰链区、CH2结构域和CH3结构域，其中该铰链区是人IgD铰链区或人IgGl铰链区的至少部分氨基酸序列；CH2结构域是人IgG4CH2结构域，在CH2结构域的N-端区一部分被人IgG2CH2或人IgD CH2结构域的N-端区的4-37氨基酸残基替代。当被连接到生物活性分子，例如生物活性多肽的生物活性分子，用于产生Fe融合蛋白时，这种杂交Fe片段使Fe融合蛋白的非特异免疫反应最小化，延长生物活性多肽的生物活性分子的血清半衰期，并使生物活性多肽的生物活性分子的活性最优化。
[0064]根据本发明的一种实施方式中的Fe融合蛋白中，设计IgD CH2结构域的N-端与IgG4CH2结构域的剩余部分的组合，使得在两个不同Ig亚基重组处产生的融合蛋白的区域是疏水性的。产生的融合蛋白的疏水区应位于折叠蛋白内部，其最小化不期望的非特异免疫反应。
[0065]如本文所用，术语“Fe片段”或“Fe”是指蛋白质，其含有免疫球蛋白的重链恒定区I (CHl)、重链恒定区2 (CH2)和重链恒定区3 (CH3)，并且不含有所述免疫球蛋白的重链和轻链的可变区以及轻链恒定区I (CLl)。它可以进一步地包括在重链恒定区的铰链区。杂交Fe或杂交Fe片段在本文有时称为“hFc”。
[0066]另外，本发明的Fe片段可以是以具有天然糖链、与天然糖链相比增加的糖链、与天然糖链相比减少的糖链的形式，或者可以是以去糖基化的形式。通过本领域常见方法，例如化学方法、酶学方法和使用微生物的基因工程方法，可以获得免疫球蛋白Fe糖链的增加、减少或去除。从Fe片段去除糖链引起与第一补体成分Cl的Clq部分的结合亲和力的锐减以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)或补体依赖性细胞毒作用(CDC)的减少或丧失，因此不会诱导不必要的体内免疫反应。就这点而言，在一些情况下，去糖基化或非糖基化(aglycosylated)形式的免疫球蛋白Fe片段作为药物载体可能更适合于本发明的目标。
[0067]如本文所用，术语“去糖基化”是指糖部分从Fe片段通过酶进行去除，和术语“非糖基化”(aglycosylation)意思是通过原核生物、优选地大肠杆菌产生未糖基化形式的Fe片段。
[0068]如本文所用，术语“杂交(杂合)”是指编码不同来源的两种或更多种免疫球蛋白Fe片段的序列是以单链免疫球蛋白Fe片段出现。
[0069]在一个实施方式中，杂交人Fe在N-端到C-端方向上包括铰链区、CH2结构域和CH3结构域，其中该铰链区是人IgD铰链区或人IgGl铰链区的至少部分氨基酸序列；以及CH2结构域是人IgG4CH2结构域，其在N-端区的一部分被人IgG2CH2或人IgD CH2结构域的N-端区的4-37个氨基酸残基替代。该杂交人Fe可以经过共价键在它的N-端连接到生物活性分子的C-端。
[0070]在另一个 实施方式中，生物活性分子-杂交Fe融合多肽可以用下式表示:[0071]N' -X-(Zl)p-Y-Z2-Z3-Z4-C/，或
[0072]N' - (Zl)p-Y-Z2-Z3-Z4-(连接体 h-X-C'
[0073]其中N'是多肽的N-端和C'是多肽的C-端；Zl表示氨基酸序列，其包括SEQ IDNO:11的90到98位置的氨基酸残基的至少C-端部分，或SEQ ID NO: 14的90-98位置的氨基酸残基的至少一部分，表示氨基酸序列，其包括SEQ ID NO: 11的99到113位置的氨基酸残基的至少C-端部分，或SEQ ID NO:14的99到162位置的氨基酸残基的至少一部分；Z2表示氨基酸序列，其包括SEQ ID NO: 12的111到147位置的氨基酸残基的至少N-端部分，或SEQ ID NO:14的163到199位置的氨基酸残基的至少N-端部分；Z3表示氨基酸序列，其包括 SEQ ID NO:11 的 118-223、SEQ ID NO:12 的 114_219、SEQ ID NO:24 的 165-270或SEQ ID NO:13的115到220位置的氨基酸残基的至少C-端部分；Z4表示氨基酸序列，其包括SEQ IDNO:13的221-327位置的氨基酸残基的至少N-端部分，并且P和q每个均是O或I的整数，其中Z2和Z3的氨基酸残基总数可以是80和140之间，两端数值包括在内，连接体是连接体分子，以及X是感兴趣的生物活性分子。
[0074]在一个实施方式中，Z3-Z4是选自以下的氨基酸序列:(i)由SEQ ID NO:11的118到223位置的氨基酸残基的C-端部分和SEQ ID NO:11的224到330位置的氨基酸残基的N-端部分组成的连续氨基酸序列，(ii)由SEQ ID NO:12的114到219位置的氨基酸残基的C-端部分和SEQ ID NO:12的220到326位置的氨基酸残基的N-端部分组成的连续氨基酸序列，(iii)由SEQ ID NO:24的165到270位置的氨基酸残基的C-端部分和SEQ IDNO:24的271到377位置的氨基酸残基的N-端部分组成的连续氨基酸序列，和(iv)由SEQID NO: 13的115到220位置的氨基酸残基的C-端部分和SEQ ID NO: 13的221到327位置的氨基酸残基的N-端部分组成的连续氨基酸序列。
[0075]根据本发明的一种实施方式，所述多肽的氨基酸残基总数是从154到288。
[0076]当施用到目标者时，与单独的X相比较，式N' -X-(Zl) p-Y-Z2-Z3-Z4-C/和N' -(Zl)p-Y-Z2-Z3-Z4-(连接体),-X-C'的多肽增加了生物活性分子X的循环半衰期。
[0077]连接体可以源于人白蛋白(CAA00606SEQ ID NO:25)。该连接体可以包括SEQ IDNO:25 的 321 到 323,318 到 325,316 到 328,313 到 330,311 到 333 或 306 到 338 位的氨基酸序列。可选地，连接体可以是合成的连接体。该合成连接体可以是由总共10-20个Gly和Ser氨基酸残基组成的肽。在一个实施方式中，该Gly-Ser连接体是GGGGSGGGGSGGGSG (SEQID NO:32)。
[0078]Zl 可以包括人 IgGl (SEQ ID NO: 11)或 IgD (SEQ ID NO:14)的 CHl 结构域的至少一部分。Zl可以包括IgGlCHl结构域的C-端区(SEQ ID NO:11的90-98的位置)或IgDCHl结构域的C-端区(SEQ ID NO:14的90-98的位置)的5到9或7到9个连续氨基酸残基。在一些实施方式中，Zl可以是IgGlCHl结构域或IgD CHl结构域的5、6、7、8或9个
C-端氨基酸残基。
[0079]在一些实施方式中，Zl是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:11的90至98位置的氨基酸残基或SEQ ID NO: 14的90至98位置的氨基酸残基。Zl可以是由SEQ ID NO:11的90至98的位置或SEQ ID NO: 14的90-98的位置的5到9个氨基酸残基组成的氨基酸序列。Zl也可以是由SEQ ID NO:` 11的90到98氨基酸残基或SEQ ID NO:14的90到98的
氨基酸残基组成的氨基酸序列。[0080]Y可以包括人IgGl或IgD的铰链区的至少一部分。Y可以包括IgGl铰链区(SEQID NO: 11的99到113位置的氨基酸)或IgD的铰链区(SEQ ID NO:14的99到162位置的氨基酸)的C-端的5个或更多个、或10个或更多个的连续氨基酸残基。在某些实施方式中，Y可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO: 11的99到113位置的氨基酸残基、SEQ IDNO:14的158到162位置的氨基酸残基、SEQ ID NO:14的153到162位置的氨基酸残基、SEQ IDNO:14的143到162位置的氨基酸残基、SEQ ID NO:14的133到162位置的氨基酸残基或SEQ ID NO:14的99到162位置的氨基酸残基。
[0081]Z2可以包括人IgG2CH2结构域的N-端(SEQ ID NO: 12的111到147位置的氨基酸残基)或IgD CH2结构域的N-端(SEQ ID NO:14的163到199位置的氨基酸残基)的4到37、6到30、6到12、6到8、8或6个连续氨基酸残基。在某些实施方式中，Z2可以是人IgG2CH2结构域的6个N-端氨基酸残基(SEQ ID NO:12的111-116位置的氨基酸残基)或人IgD CH2结构域的8个N-端氨基酸残基(SEQ ID NO:14的163-170位置的氨基酸残基)。
[0082]Z2和Z3的氨基酸残基总数可以是90和120之间，两端数值包括在内；或105和115之间，两端数值包括在内。
[0083]Z4可以是氨基酸序列，其包括IgG4CH3结构域(在SEQ ID NO:11的224_330、SEQID NO:12 的 220-326、SEQ ID NO:24 的 271-377 或 SEQ ID NO:13 的 221 到 327 位置的氨基酸残基)的90或更多个、或100或更多个连续氨基酸残基。Z4可以是大于人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4CH3结构域的98 %或95 %的氨基酸残基。在一个示例性实施方式中，TA是包括人IgG CH3结构域全部氨基酸序列的氨基酸序列。例如，Z4是人IgG4CH3结构域的氨基酸序列，对应于人IgG4的氨基酸残基341-447，如根据EU Index, Kabat编号(其对应于SEQID NO:13的221-327位置的氨基酸残基)。
[0084]在一个实施方式中`，Y可以是氨基酸序列，其包括人IgGl铰链区的C-端氨基酸残基(SEQ ID NO: 11的99到113位置)的至少一部分，p可以是I或O ;Z2可以是氨基酸序列，其包括人IgG2CH2的N-端区(氨基酸残基在SEQ ID NO:12的111-147位置)的至少一部分；和Z3可以是氨基酸序列，其包括人IgG亚类任意一个的C-端区(氨基酸残基在SEQ ID NO:11 的 118-223,SEQ ID NO:12 的 114-219,SEQ ID NO:24 的 165-270 或SEQ IDNO:13的115到220位置)的至少一部分。在该实施方式中，当P是I时，Zl可以是包括人IgGlCHl结构域的C-端区(SEQ ID NO: 11的90到98位置的氨基酸残基)的至少一部分的氨基酸序列。例如，Zl可以是SEQ ID NO: 11的90到98位的氨基酸残基。
[0085]在进一步的实施方式中，Z3可以是人IgG4CH2结构域(在SEQ ID N0:13的
115-220 位置)、人 IgGlCH2 结构域(在 SEQ ID NO:11 的 118-223 位置)、人 IgG2CH2 结构域(在 SEQ ID N0:12 的 114-219 位置)、人 IgG3CH2 结构域(在 SEQ ID NO:24 的 165-270位置)的C-端区的73到106个连续氨基酸残基，并且Z2和Z3的氨基酸残基总数可以是110。例如，Z2可以是在SEQ ID NO:12的111-116位置的氨基酸残基的氨基酸序列，以及Z3可以是在SEQ ID NO: 13的117到220位置的氨基酸残基的氨基酸序列。
[0086]在另一个实施方式中，Y可以是包括人IgD铰链区的C-端区(SEQ ID NO:14的99到162位置的氨基酸残基)的至少一部分的氨基酸序列，P可以是I或0(零)；Z2可以是包括人IgD CH2结构域的N-端区(SEQ ID NO:14的163到199位置的氨基酸残基)的至少一部分的氨基酸序列，和Z3可以是包括人IgG4CH2结构域的C-端区(SEQ ID NO:13的121到220位置的氨基酸残基)的至少一部分的氨基酸序列。例如，Y可以是在SEQ IDNO:14的158到162、133到162、或99到162位置的氨基酸残基，Z2可以是在SEQ ID NO:14的163到170位置的氨基酸残基和Z3可以是在SEQ ID NO:13的121-220位置的氨基
酸残基。
[0087]在这个实施方式中，当P是I时，Zl可以是包括人IgD CHl结构域的C端区(氨基酸残基在SEQ ID NO:14的90到98位置)的氨基酸序列。例如，Zl可以是SEQ ID NO:14的90到98位的氨基酸残基。
[0088]在这个实施方式中，Y可以是人IgD铰链区的C-端侧(氨基酸残基在SEQ ID NO:14的99-162位置)的20个连续氨基酸残基或更多个、30个连续氨基酸残基或更多个、40个连续氨基酸残基或更多个、50个连续氨基酸残基或更多个、或60个连续氨基酸残基或更多个。Z3可以包括SEQ ID NO:13的121-220位置的氨基酸残基C-端侧的71到100个连续氨基酸残基。Z2和Z3的氨基酸残基总数可以是108。
[0089]表1显示在构建根据本发明的实施方式的hFcs中有用的人IgGl、IgG2、IgG3和IgD片段的氨基酸序列。
[0091]表 I
【权利要求】
1.由下式表示的多肽:
N' -(Zl)p-Y-Z2-Z3-Z4-C/ 其中N'是所述多肽的N-端和C'是所述多肽的C-端； Zl是氨基酸序列，其由在(i)SEQ ID N0:11或(ii)SEQ ID NO: 14的90到98位置的氨基酸残基组成； Y是氨基酸序列，其由从在SEQ ID NO:14的99到162位置的氨基酸残基的C-端的5个或更多个连续氨基酸残基组成； Z2是氨基酸序列，其由从在SEQ ID NO:14的163到199位置的氨基酸残基的N-端的4个或更多个连续氨基酸残基组成； Z3是氨基酸序列，其由从在SEQ ID NO: 13的115到220位置的氨基酸残基的C-端的71个或更多个连续氨基酸残基组成； Z4是氨基酸序列，其由在SEQ ID NO:13的221到327位置的氨基酸残基组成；以及 P是O或I的整数。
2.根据前述权利要求1所述的多肽，其中P是O。
3.嵌合多肽，其由权利要求1或2所述的多肽和生物活性多肽组成，其中所述生物活性多肽被融合到所述的多肽的N-端或C-端，并且其中所述生物活性多肽显示与所述生物活性多肽的天然形式的循环半衰期相比增加的循环半衰期，并且所述生物活性多肽是EPO、G-CSF、TNF 受体或 p40。
4.根据权利要求3所述的嵌合多肽，其中所述生物活性多肽是p40变体，所述p40变体包含Asn303Gln置换。
5.根据权利要求3所述的嵌合多肽，其中: (a)所述生物活性多肽是分泌性蛋白，分泌性蛋白的成熟形式、或抗体的Fab区；和/或 (b)所述多肽和所述生物活性多肽经由连接体例如白蛋白连接体或合成的连接体彼此偶联。
6.根据权利要求5所述的嵌合多肽，其中: (a)所述白蛋白连接体由SEQID NO:25的321至323、318至325、316至328、313至330,311至333或306至338的氨基酸序列组成；或 (b)所述合成的连接体是由SEQID NO:32所示的肽。
7.编码前述权利要求1-6任意一项多肽的核酸分子。
8.包括根据权利要求7所述核酸分子的表达载体。
9.产生根据权利要求1-6任意一项所述的多肽的方法，其中所述方法包括下列步骤:(i)将权利要求11的核酸分子引入哺乳动物宿主细胞，(?)将所述细胞在其生长培养基中在所述多肽可以被表达的条件下生长；以及(iii)收获所表达的多肽。
10.根据权利要求3所述的嵌合多肽在制备用于增加所述生物活性多肽的循环半衰期的药物中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述嵌合多肽经静脉内、皮下、经口、经颊、舌下、经鼻、肠胃外、直肠、阴道或经由肺部途径施用。
【文档编号】C12N15/85GK103641919SQ201310554079
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2008年5月30日 优先权日:2007年5月30日
【发明者】成永喆, 梁世焕 申请人:浦项工科大学校产学协力团, 格纳西尼有限公司