用于人间充质干细胞的培养基的制作方法
【专利摘要】本发明涉及新型的用于人间充质干细胞（hMSC）的培养基。更具体地，本发明涉及其中hMSC细胞系能够生长的培养基，包括在通常用于这类细胞的培养基中不能生长的那些细胞系。所述用于人间充质细胞的培养基包括通常用于培养间充质干细胞的基础培养基；人白细胞/血小板层溶解产物（血沉棕黄层）；胰岛素；亚硒酸钠；乙醇胺；以及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。
【专利说明】用于人间充质干细胞的培养基
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于人间充质干细胞(hMSC)的新型培养基。更具体地，本发明涉及其中hMSC细胞系能够生长的培养基，包括因为已经适应了特定培养基在通常用于这类细胞的培养基中不能生长的那些细胞系。
【背景技术】
[0002]hMSC是多能细胞，根本特征在于它们能够分化成多种间充质组织，如骨、软骨、腱、肌肉和脂肪组织等。hMSC可以从成人体内的多种组织中分离，包括可以在骨髓、脂肪组织和脐带血中发现的那些hMSC。
[0003]hMSC的抗增殖、免疫调节和消炎的作用已经将注意力集中在这些细胞上，作为由免疫系统引起的疾病(包括移植物抗宿主病、实体器官移植后排斥和自身免疫疾病)的潜在治疗剂。
[0004]众所周知，对于hMSC的体外培养来说需要保持其多能性，并且为此需要向普通培养基中加入外源因子，例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和转化生长因子(TGF β -1)。然而，多数hMSC依赖于特定的培养基，并且不能在通常用于间充质干细胞培养的培养基上(如 适用于间充质干细胞(MSCQ)的补充有胎牛血清的DMEM/F12培养基)进行培养。
【发明内容】
[0005]为了克服这些问题，本发明涉及用于hMSC的新型培养基，在其上可以使在其他培养基配制物中不生长的hMSC进行生长。根据本发明的培养基包括:
[0006]a)通常用于间充质干细胞培养的基础培养基
[0007]b)人白细胞/血小板层溶解产物(血沉棕黄层；LBC)
[0008]c)胰岛素
[0009]d)亚硒酸钠
[0010]e)乙醇胺
[0011]f)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)
[0012]如在本文件中使用的，术语“培养基”是指用于细胞培养、生长或增殖的营养溶液。术语“细胞培养”是指在人造的体外环境中维持、培养或生长的细胞。
[0013]在本文件中使用的术语“基础培养基”是指其中当补充有不同补充物时人间充质细胞可以生长的任何培养基，补充物可以包含血清或不包含血清。基础培养基提供标准无机盐如锌、铁、镁、钙和钾，以及维生素、葡萄糖、缓冲体系和必需氨基酸。
[0014]优选地，根据本发明通常用于培养基中间充质细胞培养的基础培养基是DMEM/F12+丙酮酸盐(DMEM/F12培养基是相同份数的Dubelcco改良Eagle培养基(Dubelcco’ sModified Eagle Medium,DMEM)(其是由Harry Eagle开发的最低基础培养基的改进物)和Ham’s F12 (其由Ham开发用于中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary, CHO )细胞的生长)培养基的混合物)、Ham’ s F10、Ham’ s F12、MCDB131 (由Knedler和Ham开发的培养基，作为具有减少的血清补充物用于人细胞生长的培养基)、或RPMI1640 (其名字来源于RoswellPark Memorial Institute的首字母,其中它由Moore及其同事开发,用于正常淋巴细胞和肿瘤性淋巴细胞的培养，尽管当适量补充时它也可以使其他不同类型的细胞生长)。这些培养基的配制物和组合物广为人知并且可以从任何生产商和供应商处获得，例如Gibc0(LifeTechnologies)。更优选地，培养基是DMEM/F12+丙酮酸盐。
[0015]根据本发明用于人间充质细胞的培养基的一种成分是白细胞/血小板层溶解产物。白细胞/血小板层，也称为“血沉棕黄层”，是全血离心或沉降后在血浆和红细胞之间观察到的层。它基本上包括白细胞和血小板。白细胞/血小板层溶解产物(血沉棕黄层)以5%至20% (v/v)、更优选7%至15% (v/v)、并且最优选10% (v/v)的量存在于根据本发明的培
养基中。
[0016]根据本发明培养基的另一种成分是胰岛素。胰岛素对细胞生长的有益作用是已知的(Cartwright, T.y Shah, G.P Culture media.Basic cell culture, 2ndedition, Davis, J.M.ed.2002.0xford University Press, New York, USA)。膜岛素优选以2mg/L至20mg/L、更优选5mg/L至15mg/L并且最优选lOmg/L的量存在于根据本发明的培
养基中。 [0017]此外，根据本发明的培养基的另一种成分是以亚硒酸钠形式存在的硒。硒是痕量元素，通常由血清提供给培养基，并且对培养基来说是必需的。亚硒酸钠以0.005至
1.730mg/L的量存在于培养基中。
[0018]进一步地，根据本发明用于人间充质细胞的培养基包括乙醇胺。众所周知，乙醇胺促进细胞膜的构建。在根据本发明的培养基中的乙醇胺以lmg/L至8mg/L、优选2mg/L至5mg/L的量存在。
[0019]最后，根据本发明用于人间充质细胞的培养基还包括bFGF。众所周知，bFGF推荐用于培养间充质细胞(Sato, J.et al.Specific cell types and their requirements.Basic cell culture, 2nd edition, Davis, J.M.ed.2002.0xford University Press, NewYork, USA)。bFGF以5ng/L至25ng/L的量存在于根据本发明的培养基中。
[0020]出乎意料的是，通过在根据本发明的培养基中成分的组合，培养人间充质细胞系是可能的，包括适应通常可商购的其他培养基的那些细胞系，它们不能在通常用于这类细胞的培养基中进行生长，例如由Lonza或PromoCell提供的人间充质细胞。
[0021]可选地，根据本发明的培养基包括抗生素。可以使用通常用于培养这类细胞的任何抗生素。优选地，该抗生素是庆大霉素/两性霉素的混合物。需用于培养基的抗生素的量可以由本领域技术人员容易地确定。
[0022]对于间充质干细胞的生长来说，需要为根据本发明的培养基补充，例如胎牛血清(FBS)或源自人血浆的细胞培养补充物(CCS)，例如依照美国专利US8，252，590B2中描述获得的。如果使用FBS，则认为10%至20% (v/v)的量是足够的。另一方面，如果使用CCS来补充根据本发明的培养基，则认为10%至40% (v/v)的量是足够的。
[0023]根据本发明用于人间充质干细胞的培养基可以是干燥形式或液体形式。对于以干燥形式使用来说，它的成分可以在合适的液体中溶解，用于培养间充质细胞。对于本领域的技术人员而言，其中可以溶解根据本发明的培养基成分的液体类型是众所周知的，例如灭菌蒸馏水。
[0024]以下通过参考多个【具体实施方式】进一步详细地描述了本发明。然而，这些实施例并不旨在限制本发明的范围。
【具体实施方式】
[0025]实施例
[0026]实施例1
[0027]制备了根据本发明的培养基，包含作为基础培养基的DMEM/F12+丙酮酸盐、10%(v/v)的人白细胞/血小板层溶解产物(血沉棕黄层)、10mg/L的胰岛素、0.0067mg/L的亚硒酸钠、2mg/L乙醇胺以及20ng/mL的bFGF。这种培养基称为LV2。培养基LV2单独使用，或补充有10% (v/v)的适用于间充质干细胞(MSCQ)的胎牛血清(FBS)或补充有15% (v/V)的源自人血衆的细胞培养补充物(CCS)。培养了可以由Lonza (Basel, Switzerland)或PromoCell (Heidelberg, Germany)商购的hMSC。使用由制造商推荐的培养基作为阳性对照。仅一种可商购的基础培养基作为阴性对照。结果显示在表1中。
【权利要求】
1.一种用于人间充质细胞的培养基，其特征在于它包括: a)通常用于培养间充质干细胞的基础培养基； b)人白细胞/血小板层溶解产物(血沉棕黄层); c)胰岛素； d)亚硒酸钠； e)乙醇胺；以及 f)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
2.根据权利要求1所述的用于人间充质细胞的培养基，其特征在于所述间充质干细胞基础培养基是 DMEM/F12+丙酮酸盐、Ham’ s F10、Ham’ s F12、MCDB131 或 RPMI1640。
3.根据权利要求1或2所述的用于人间充质细胞的培养基，其特征在于所述人白细胞/血小板层溶解产物(血沉棕黄层)以5%至20% (v/v)的量存在于所述培养基中。
4.根据权利要求3所述的用于人间充质细胞的培养基，其特征在于所述人白细胞/血小板层溶解产物(血沉棕黄层)以7%至15% (v/v)的量存在于所述培养基中。
5.根据前面权利要求中任一项所述的用于人间充质细胞的培养基，其特征在于所述胰岛素以2mg/L至20mg/L的量存在。
6.根据权利要求5所述的用于人间充质细胞的培养基，其特征在于所述胰岛素以5mg/L至15mg/L的量存在。
7.根据前面权利要求中任一项所述的用于人间充质细胞的培养基，其特征在于所述亚硒酸钠以0.005mg/L至1.730mg/L的量存在。
8.根据前面权利要求中任一项所述的用于人间充质细胞的培养基，其特征在于所述乙醇胺以lmg/L至8mg/L的量存在。
9.根据权利要求8所述的用于人间充质细胞的培养基，其特征在于所述乙醇胺以2mg/L至5mg/L的量存在。
10.根据前面权利要求中任一项所述的用于人间充质细胞的培养基，其特征在于所述bFGF以5ng/L至25ng/L的量存在。
11.根据前面权利要求中任一项所述的用于人间充质细胞的培养基，其特征在于它进一步包括抗生素。
12.根据权利要求11所述的用于人间充质细胞的培养基，其特征在于所述抗生素是庆大霉素/两性霉素的混合物。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的用于人间充质细胞的培养基，其特征在于所述培养基以10%至20% (v/v)的量补充有胎牛血清(FBS)。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的用于人间充质细胞的培养基，其特征在于所述培养基以10%至40% (v/v)的量补充有源自人血浆的细胞培养补充物(CCS)。
【文档编号】C12N5/0775GK103805561SQ201310553617
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2012年11月13日
【发明者】乔斯·玛丽亚·迭斯塞万提斯, 罗德里戈·加哈尔多罗德里格斯 申请人:基立福有限公司