美洲短吻鳄Cathelicidin-AM抗菌肽及其编码序列和用途
【专利摘要】本发明提供了一种美洲短吻鳄Cathelicidin-AM抗菌肽、编码该抗菌肽的多核苷酸以及该抗菌肽的用途。该抗菌肽是含有SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列。编码该抗菌肽的多核苷酸是含有编码SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列或者其互补序列。该抗菌肽对多种细菌有明显的抑制作用，对大肠埃希氏菌（CMCC44102）、大肠埃希氏菌（ATCC25922）、鼠伤寒沙门菌（CMCC50115）的最小抑菌浓度（MIC）达到了62.5μg/mL。该抗菌肽可以用于制备如饲料添加剂、防腐剂、农用生物防治剂、控制微生物感染的治疗药物组合物等。
【专利说明】美洲短吻鳄Cathe I icidi η-AM抗菌肽及其编码序列和用途
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及Cathelicidin抗菌肽家族的抗菌肽，尤其涉及一种美洲短吻鳄Cathelicidin-AM抗菌肽。此外,本发明还涉及编码该抗菌肽的核苷酸序列以及该抗菌肽的用途。
【背景技术】
[0002]由于抗生素的乱用与滥用，许多细菌产生了耐药菌株，而新型抗生素的研发速度又不够快，因此新抗生素研发与抗菌需求之间的矛盾日益突出。另外，抗生素在畜产品中的残留问题也越来越引起人们的重视，它直接危害到了人类的健康。抗菌肽独特的抗菌机理为这一问题的解决提供了可能，因此极有希望被开发成为一类新型的高效抗菌药物。
[0003]抗菌肽是存在于动物体内的一类具有广谱抗菌活性的多肽，也是先天免疫系统中重要的组成部分。到目前为止，人们已经从哺乳动物、昆虫及两栖动物中发现了几百种抗菌肽，并对其结构、活性、作用机理等做了大量的研究，发现抗菌肽抗菌活性高，抗菌谱广，作用机理与普通抗生素通过抑制蛋白的合成来达到杀菌效果的特点有很大的不同，它们是通过破坏细菌的细胞膜来致死细菌的，因此不易产生耐药性。大多数的抗菌肽都具有以下特点:分子量小，热稳定性好，带有正电荷，并且是两性分子。根据抗菌肽的这些特征，人们将抗菌肽分成两大类:defensins(防御素)和Cathelicidins。
[0004]Cathelicidin这一名词从1995年开始被用来描述具有Cathelin和C端抗菌肽两种结构域的分子。由于Cathelicidin家族成员多种多样,其抗菌机制不尽相同。它们对细菌、真菌、病毒和寄生虫的感染都具有抵抗作用，要么直接杀死病原体，要么通过结合内毒素而减轻因病原微生物感染引起的各种生物学效应。其中最主要的机制之一是Cathelicidin能够在病原体的质膜表面形成跨膜离子通道,造成细胞内容物的渗出从而导致细菌的死亡。Cathelicidin具有强大的结合细菌脂多糖(LPS)的能力。在与细菌胞浆膜磷脂分子吸附而结合在脂质膜上之后，Cathelicidin分子聚集成团，其疏水端借助分子中柔性的连接结构插入到质膜中，而亲水端指向膜的内部以形成跨膜离子通道，能允许多种物质包括疏水复合物、小分子通过。于是膜的完整性受到破坏，胞内离子大量丢失，最终导致细菌的死亡。平面磷脂双层的试验表明:质膜通透性的改变可能是由于通道的形成而导致的。具有ct螺旋结构的Cathelicidin家族肽,能够快速地渗入到敏感菌的质膜中，从而改变其通透性，而在杀菌浓度下，内膜的完整性被破坏，导致细胞呼吸显著减少，细菌随之死亡。除了抗菌活性以外，Cathelicidin还具有其他重要的生物学功能，包括促进创伤修复、作为化学引诱剂召集炎症细胞到达炎症部位、诱导血管生成、结合内毒素以及诱导细胞溶解等。Cathelicidin的这些生物学效应增强了宿主的防御机制,促使机体能够从病原体感染中恢复过来。
[0005]中药宝典《本草纲目》认为“鼍(即鳄)甲:主治心腹症瘕；伏孥积聚；寒热；女子小腹阴中相引痛、崩中下血五色及疮疥死肌……肉:主治少气吸吸，足不立地；别录湿气邪气、诸蛊，腹内症瘕、恶疮。 脂:主治摩风及恶疮……”。上述“症瘕”和“积聚”主要指现代医学中的卵巢癌和肝癌，“少气吸吸”即为今天的咳嗽、哮喘。现代医学发现鳄鱼制品具有明显的医药保健功效。有研究发现湾鳄鳞甲提取物对小鼠的肿瘤有抑制作用。研究者用鳄鱼、罗汉果和甘草按一定比例研制了鳄鱼止咳膏，发现其对小鼠有明显的镇咳、祛痰、抗炎以及免疫调节作用。
[0006]为了能够抵御外来压力，在长期的演化过程中，鳄鱼进化出了大量抗菌肽类物质。目前发现的许多鳄鱼抗菌肽对大肠杆菌、肺炎双球菌等菌株具有一定的抑菌作用，但对哺乳动物正常的组织细胞不存在毒害作用，其作为抗生素类药物的替代品，在临床、食品以及饲料业具有很高的应用价值。从鳄鱼体中直接提取抗菌肽方法复杂，产量甚微；采用化学合成法制备抗菌肽成本太高，均无实际应用的可能。因此利用基因重组技术在微生物中直接表达鳄鱼抗菌肽便成为解决这一问题的出路。
【发明内容】
[0007]针对上述现有技术中的缺陷，本发明的一个目的在于提供一种美洲短吻鳄Cathelicidin-AM抗菌肽，本发明的另一目的在于提供一种编码该抗菌肽的核苷酸序列以及该抗菌肽的用途。
[0008]一方面，本发明提供了一种美洲短吻鳄Cathelicidin-AM抗菌肽，其特征在于所述多肽选自下组:
[0009](a) SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；
[0010](b) SEQ ID NO:2氨基酸序列经过修饰所得到的功能等同的多肽衍生物；
[0011](c)SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加所形成的功能等同的衍生多肽。
[0012]第二方面，本发明提供了还一种多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸的核苷酸序列选自下组:
[0013](a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；
[0014](b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
[0015]优选地，所述多核苷酸编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽或其互补序列。
[0016]更优选地，所述多核苷酸的序列选自下组的一种:
[0017](a) SEQ ID NO:1 中 17-139 位的序列；
[0018](b)由于遗传密码的简并性而衍生自多核苷酸序列(a)的序列；
[0019](c)多核苷酸序列(a)和(b)的互补序列。
[0020]第三方面，本发明还提供了还一种表达载体，其特征在于所述表达载体含有至少上述任意一种所述的多核苷酸。
[0021]第四方面，本发明还提供了一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞含有上述表达载体，或其基因组中整合有至少上述任意一种所述的多核苷酸。
[0022]优选地，所述的遗传工程化的宿主细胞是将权利要求5所述的表达载体转化枯草芽孢杆菌而得到的。
[0023]第五方面，本发明还提供了一种制备如上述美洲短吻鳄Cathelicidin-AM抗菌肽的方法，其特征在于所述多肽·通过固相化学法合成或通过基因重组方法生成，所述基因重组方法包括以下步骤:[0024]1)在适当的培养基中，将权利要求5所述的表达载体转化或转染宿主细胞；
[0025]2)筛选阳性克隆；
[0026]3)诱导表达如权利要求1所述的抗菌肽；
[0027]4)回收条件培养基或细胞提取物，
[0028]5)从获得的所述培养基或细胞提取物分离并纯化所述多肽。
[0029]第六方面，本发明还提供了上述美洲短吻鳄Cathelicidin-AM抗菌肽在在制备饲料添加剂、防腐剂、农用生物防治剂或控制微生物感染的治疗药物组合物中的用途。
[0030]第七方面，本发明还提供了一种用于控制微生物感染的治疗药物组合物，其特征在于所述药物组合物包括权利要求1所述的抗菌肽。
[0031]第八方面，本发明还提供了一种饲料添加剂，其特征在于所述饲料添加剂包括权利要求I所述的抗菌肽。
[0032]第九方面，本发明还提供了一种防腐剂，其特征在于所述防腐剂包括权利要求1所述的抗菌肽。
[0033]第十方面，本发明还提供了一种农用生物防治剂，其特征在于所述农用生物防治剂包括权利要求1所述的抗菌肽。
[0034]本发明的美洲短吻鳄Cathelicidin-AM抗菌肽具有抗菌活性，可以杀死细菌、真菌、病毒和原生动物。这些抗菌肽总体上对任何具有细胞膜或脂双层膜组分的生物体有作用。该抗菌肽是可以应用在人类和/或牲畜药物、兽用或者作为农业、食品及工业上试剂的有效化合物。
[0035]此外，本发明的抗菌肽及其多核苷酸序列还具有下列用途:
[0036]1.该Cathelicidin-AM抗菌肽与白蛋白偶联后免疫动物，可以制备与Cathelicidin-AM抗菌肽特异性结合的抗体。该抗体可以用于检测溶液中的抗菌肽的存在。
[0037]2.将SQ ID NO:1或者与其互补的多核苷酸(包括DNA或者RNA)，或者其片段，进行标记后，可以通过Southern、Northern、基因芯片等技术,检测动物基因组中的抗菌肽基因片段的存在，或者检测抗菌肽基因的转录情况。
[0038]3.根据SQ ID NO:1或者与其互补的多核苷酸设计引物，可以通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测抗菌肽基因在动物体内各组织中、不同发育阶段的转录情况。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1为美洲短吻鳄粘膜上皮组织总RNA电泳图。
[0040]图2为美洲短吻鳄粘膜上皮组织cDNA文库重组质粒的菌落PCR电泳图。其中:M.DNA标记；1.空白对照；2-5.PCR目的条带。
[0041]图3为美洲短吻鳄Cathelicidin-AM抗菌肽基因的PCR电泳结果。其中:M.DNA标记；l-4.Cathelicidin-AM抗菌肽基因PCR条带。
[0042]图4为P43启动子和nprB信号肽基因PCR电泳图。其中:M.DNA标记；1_2.P43启动子的条带；3-4.nprB信号肽的条带。
[0043]图5为重叠延伸扩增和SOE融合电泳图。其中:M.DNA标记；1.nprB和P43融合片段；2.P43-SP-CathAM 融合片段。
[0044]图6为Cathelicidin-AM抗菌肽的重组表达质粒pHY43N_cathAM构建图。[0045]图7为pHY43N_cathAM的阳性克隆检测电泳图。其中:M.DNA标记；1.阳性克隆；
2.空白对照；3.阴性对照。
[0046]图8为美洲短吻鳄Cathelicidin-AM抗菌肽重组表达产物的SDS-PAGE电泳图。其中:1.蛋白质标记；2.未加诱导的pHY43N-cathAM WB800菌体；3.加诱导的pHY43N_cathAMWB800菌体4.纯化的Cathelicidin-ΑΜ抗菌妝。
[0047]图9为美洲短吻鳄Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽离子交换分析纯化图。
[0048]图10为美洲短吻鳄Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽对大肠埃希氏菌的抑菌效果。
[0049]图11为美洲短吻鳄Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽对鼠伤寒沙门菌的抑菌效果。
[0050]图12为美洲短吻鳄Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽对C型产气荚膜梭菌的抑菌效果。
[0051]图13为美洲短吻鳄Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽对流感嗜血杆菌的抑菌效果。
[0052]图14为美洲短吻鳄Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽对副溶血性弧菌的抑菌效果。
[0053]图15为美洲短吻鳄Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽对空肠弯曲菌的抑菌效果。
[0054]图16为美洲短吻鳄Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。
[0055]图17为美洲短吻鳄Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽对单核细胞增生李斯特氏菌的抑菌效果。
[0056]图18为美洲短吻鳄Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽对肺炎链球菌的抑菌效果。
【具体实施方式】
[0057]本发明通过构建美洲短吻鳄皮肤组织cDNA文库，并通过测序和筛选，获得了一种美洲短吻鳄Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽的cDNA。同时，通过人工合成方法(固相化学法)和基因重组方法，分别获得了该抗菌肽cDNA所编码的多肽片段。在本发明的实施方案中，该Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽多肽含有41个氨基酸，最优选为含有SQ ID NO:2中I至41位的氨基酸序列。将该抗菌肽氨基酸序列经蛋白质数据库进行比较，未发现有任何相同Cathelicidin 成熟妝。
[0058]本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。在本发明中，术语“衍生物”是指基本上保持本发明的Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列)。这些衍生物和类似物属于本领域技术人员公知的范围。
[0059] 在本发明中，还包括具有与Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽相同功能的、SEQ ID N0.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):一个或多个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。变异形式还包括:同源序列、保守性变异体等。本发明还提供了其他多肽，如包含该Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽或其片段的融合蛋白。
[0060]本发明的多核苷酸可以是单链的或是双链的。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。本发明的多核苷酸还包括编码成熟多肽的编码区序列的互补序列，例如SEQ ID NO:1的互补序列SQ ID NO:3。
[0061]编码美洲短吻鳄Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
[0062]本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，多核苷酸变异体是多核苷酸的替换形式，不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
[0063]本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或该抗菌肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
[0064]本发明中，美洲短吻鳄Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。
[0065]本发明中，宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，枯草芽孢杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞等。本发明的宿主细胞优选为枯草芽孢杆菌，因为枯草芽孢杆菌通常可以直接作为饲料添加剂，当用枯草芽孢杆菌作为宿主细胞表达本发明的抗菌肽，且打算将该抗菌肽应用于饲料添加剂时，不需要对该抗菌肽进行分离纯化，可以直接将诱导表达后的枯草芽孢杆菌培养液作为饲料添加剂，里面含有办发明的Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽。
[0066]本发明的Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽可以通过常规的化学固相法合成，并将C端酰胺化。本发明优选为通过常规的重组DNA技术表达出重组Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽。一般来说有以下步骤:
[0067]I)在适当的培养基中，将构建好的表达载体转化或转染宿主细胞；
[0068]2)筛选阳性克隆；
[0069]3)诱导表达本发明的Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽抗菌肽；
[0070]4 )回收条件培养基或细胞提取物，
[0071]5)从获得的所述培养基或细胞提取物分离并纯化所述多肽。
[0072]本实施方案中的抗菌肽对多种革兰氏阳性细菌及革兰氏阴性细菌有很强的抑制作用(参见实施例五，表1)。在本实施方案中选取的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等菌种在本领域中被认为是革兰氏阳性及阴性细菌的模式生物，因此对这些模型细菌的生物活性可以被认为是对整个革兰氏阳性及阴性细菌家族的生物活性。因此，本发明的CatheIicidin-AM抗菌肽可以作为杀菌试剂或者抑菌试剂用来阻止传染、杀死微生物或者抑制微生物生长及其它功能，并因此可以有效治疗或者控制由这些微生物引起的感染或者造成的污染。该抗菌肽还可以被用于饲料添加剂、农用生物防治剂等，增加畜产品对微生物的抵抗力，为畜产品提供了新的抗菌途径，具有广泛的应用前景。
·[0073]同时，本发明的Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽也可以做为治疗药物组合物,适合人类、牲畜、农业及药业使用，其包括本发明的抗菌肽中的一种或者多种以及药物上可以接受的载体。这些药物组合物可以根据本领域中已知的，进行配制和给药例如口服、注射或外用给药应用以控制和/或抑制包括革兰氏阳性及阴性细菌的宽范围微生物的感染。
[0074]以下结合实施例进一步说明本发明的内容，但实施例不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明的方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0075]实施例一:Cathelicidin_AM抗菌肽的固相化学合成法
[0076]根据编码美洲短吻鳄Cathelicidin抗菌肽基因推断出Cathelicidin-ΑΜ成熟肽氨基酸序列，按照标准固相肽合成程序人工合成该Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽。合成肽经反相-高压液相层析(RP-HPLC, Column:X Bridge 4.6X250mm)脱盐、纯化，采用乙臆 / 水 / 三氟乙酸系统洗脱(Pump A:0.07% trifluoroacetic in 100% water ;Pump B:0.05% trif luoroacetic in 100% acetonitrile),米用电喷雾质谱(ES1-MS)测定其分子量。样品纯度>96%，其理论分子量为4546，实测分子量为4547.70，基本一致。将合成的Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽溶于灭菌双蒸水,用于活性检测。
[0077]实施例二:美洲短吻鳄Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽cDNA的获取
[0078]本发明人用TaKaRa公司Smart? cDNA文库构建试剂盒,构建了美洲短吻鳄皮肤组织cDNA文库，通过随机挑取克隆测序，并将测得序列用BLAST与国际基因库(GenBank)中的序列进行比较，获得了 Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽的cDNA。
[0079]1.美洲短吻鳄粘膜上皮组织总RNA的提取
[0080]取美洲短吻鳄粘膜上皮组织于冻存管中，随之将美洲短吻鳄释放，冻存管置于液氣运回实验室，存于液氣te中备用。
[0081]取粘膜上皮组织0.1g,液氮低温研磨成粉末状。加入2mL RNAiso Reagen室温静置至融化，再研磨至裂解液成透明状。4°C、12000r/min离心5min。上清液中加入0.2mL氯仿，充分乳化溶液呈乳白状后，于4°C、12000r/min离心15min，异丙醇沉淀，4°C、12000r/min离心IOmin收集沉淀。DEPC处理水配制的75%乙醇溶液洗漆。室温干燥,RNase-free水溶解沉淀RNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测可以见到清晰的28S和18S两条带(电泳结果见图1);以OD26Q/OD280比值鉴定总RNA的纯度，其比值为1.95 ;_80°C保存。
[0082]2.第一链cDNA的合成
[0083](I) RNA 的热变性:
[0084]总RNA (0.25 μ g/ μ L) 2 μ L
[0085]SMART IV 寡聚核酸2 μ L
[0086]CDS 111/3，PCR 引物 IyL
[0087]总体积5yL
[0088]将以上成分混匀，在离心机上甩一下，于65°C孵育变性5min，立即放于冰上。
[0089](2)反应液配置:
[0090]
【权利要求】
1.一种美洲短吻鳄Cathelicidin-AM抗菌肽，其特征在于，所述多肽选自下组: (a)SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽； (b)SEQID NO:2氨基酸序列经过修饰所得到的功能等同的多肽衍生物； (c)SEQID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加所形成的功能等同的衍生多妝。
2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列选自下组: (a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸； (b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于:所述多核苷酸编码SEQID N0:2所示氨基酸序列的多肽或其互补序列。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列选自下组的一种:
(a)SEQ ID NO:1 中 17-139 位的序列； (b)由于遗传密码的简并性而衍生自多核苷酸序列(a)的序列； (C)多核苷酸序列(a)和(b)的互补序列。
5.—种表达载体,其特征在于:所述表达载体含有至少一种如权利要求2、3、4中任意一项所述的多核苷酸。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于:所述宿主细胞含有权利要求5所述的表达载体，或其基因组中整合有至少一种如权利要求2、3、4中任意一项所述的多核苷酸。
7.如权利要求6所述的遗传工程化的宿主细胞，其特征在于:所述宿主细胞是将权利要求5所述的表达载体转化枯草芽孢杆菌而得到的。
8.一种制备如权利要求1所述的Cathelicidin-AM抗菌肽的方法,其特征在于:所述多肽通过固相化学法合成或通过基因重组方法生成，所述基因重组方法包括以下步骤: 1)在适当的培养基中，将权利要求5所述的表达载体转化或转染宿主细胞； 2)筛选阳性克隆； 3)诱导表达如权利要求1所述的抗菌肽； 4)回收条件培养基或细胞提取物， 5)从获得的所述培养基或细胞提取物分离并纯化所述多肽。
9.权利要求1所述的美洲短吻鳄Cathelicidin-AM抗菌肽在在制备饲料添加剂、防腐剂、农用生物防治剂或控制微生物感染的治疗药物组合物中的用途。
10.一种用于控制微生物感染的治疗药物组合物，其特征在于:所述药物组合物包括权利要求1所述的抗菌肽。
11.一种饲料添加剂，其特征在于:所述饲料添加剂包括权利要求1所述的抗菌肽。
【文档编号】A23L3/3526GK103665137SQ201310553924
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】汪猜, 皮灿辉, 陈荣 申请人:广州和仕康生物技术有限公司