一株降解afb1的枯草芽孢杆菌的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一株降解AFB1的泰山枯草芽孢杆菌；于2013年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC?No?8186,其16srDNA如SEQ.NO.1所示。经实验证明，将其发酵液与发霉饲料于37℃下共同作用72h，发酵液产生的活性物质能降解发霉饲料中的AFB1，且效率高，作用效果温和，安全性高，不影响原有品质，而且具有操作简单、成本低等优点，适合在饲料方面规模应用。
【专利说明】—株降解AFB1的枯草芽孢杆菌
(-)发明领域
[0001]本发明涉及从一株降解AFBl的枯草芽孢杆菌。
(二)发明背景
[0002]黄曲霉毒素(Aflatoxius, AF)是由黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillums nomius)、特异曲霉(A.nomius)、假溜曲霉(A.pseudotamarii)等几种真菌产生的次生代谢产物，对人类和畜禽的健康危害很大。1960年6月，在英国伦敦郊区的10万只火鸡突然发病死亡，追究原因是从巴西进口的花生柏被一种来自真菌的有毒物质污染。剖检后发现肝脏出血，肾脏肿胀，因病因不明，被定为火鸡χ病。后经过研究发现，火鸡的死亡原因由饲料中分离出的黄曲霉所产生的荧光物质造成的，将此物质命名为黄曲霉毒素，该结果引起了全世界的关注。后来经过许多学者的研究证明，黄曲霉毒素不但可以引起中毒，长期食用被其污染的食品还可引发癌症，具有很强的毒性、致癌性、致突变性和致畸性，它可通过食物和饲料直接危害人类和动物的健康.[0003]黄曲霉素B1 (AFBl)广泛存在于饲料原料中如玉米、高粱、花生粉、豆柏、棉籽柏等。到目前为止，黄曲霉毒素仍是对畜牧业威胁最大的霉菌毒素之一。各种动物对黄曲霉毒素均具有很高的敏感性。Madden等(1999年)报道，日粮中含0.2mg / kg黄曲霉毒素即可引起家禽采食量和增重降低，降低程度与黄曲霉毒素浓度有关。Prasad (2002年)研究了AFBl对家禽的影响发现，单一剂量AFBl的平均半数致死量(LD50) (mg / kg体重)鸡6.5~16.5、鸭0.34，鸭比鸡更敏感，尤其是雏鸭。对于生长禽日粮中的AFBl的安全值，一般认为不应超过20ug / kg。研究还发现，通过食物链进入人体的黄曲霉毒素具有极强的致癌作用，严重威胁人类健康，因此，解决谷物粮食和动物饲料的黄曲霉毒素污染是一个世界性难题。
[0004]传统的黄曲霉毒素去毒方法有物理和化学方法，包括氨化法、碱法、高温法、氧化法、吸附剂法，这些方法存在 效果不稳定、营养成分损失较大以及难以规模化生产等缺点；因此，黄曲霉毒素污染的控制急切需要一种高效率、特异性强以及对饲料和环境没有污染的技术。黄曲霉毒素生物降解，是指黄曲霉毒素分子的毒性基团被微生物产生的次级代谢产物或者所分的胞内、胞外酶分解破坏，同时产生无毒的降解产物的过程。毒素生物降解是一种化学反应的过程，不是对毒素的物理性吸附作用。利用微生物或其代谢产物进行解毒具备以上优势，代表了生物解毒的新方向，且生物酶催化方法具有专一性强、转化效率高的特点备受研究者的关注。
(三)
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，本发明从泰山土壤中分离得到一株降解AFBl的泰山枯草芽孢杆菌；经实验证明，泰山枯草芽孢杆菌发酵液及其产生的活性物质降解AFBl的效率高，作用效果温和，安全性高，不影响原有品质，适合在食品及饲料方面规模应用。
[0006]一株泰山枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),于2013年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编:100101 ;保藏号CGMCC No8186,其16srDNA如SEQ.N0.1所
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[0007]所述泰山枯草芽孢杆菌形态如下:
[0008]菌落形状不规则，有皱褶，边缘波纹状，灰白色，革兰氏染色阳性，MR-VP试验阳性，淀粉水解阳性。
[0009]挑取泰山枯草芽孢杆菌于50ml BPY液体培养基(牛肉提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、葡萄糖5g、酵母浸粉5g和蒸馏水lL，pH=7.0)培养8h后，以6%接种量将此菌液接种于100mlBPY液体培养基中，在37°C、180r/min条件下摇瓶培养24h制得枯草芽孢杆菌发酵液，将其与发霉饲料于37°C下共同作用72h，发酵液产生的活性物质能降解发霉饲料中的AFB I。
[0010]本发明的有益效果主要体现在:
[0011]本研究从泰山土壤中分离了一株枯草芽孢杆菌，将其发酵液与发霉饲料于37°C下共同作用72h，发酵液产生的活性物质能降解发霉饲料中的AFB1，且效率高，作用效果温和，安全性高，不影响原有品质，而且具有操作简单、成本低等优点，适合在饲料方面规模应用。
[0012](五)发明附图
[0013]图1泰山枯草芽孢杆菌发酵液不同组分对AFBl的降解率。由图可知，泰山枯草芽孢杆菌对黄曲霉毒素降解的活性物质是一种胞外分泌物，主要存在于其发酵后的上清液中。
[0014]图2泰山枯草芽孢杆菌发酵后`的上清液热处理和蛋白酶K处理后对AFBl的降解率。由图可知，泰山枯草芽孢杆菌对黄曲霉毒素的降解活性物质是发酵上清液中的一种酶.[0015]图3经泰山枯草芽孢杆菌发酵液处理前后霉变饲料中AFBl含量图。
[0016]由图可知，经泰山枯草芽孢杆菌发酵液处理后霉变饲料中AFBl含量由63.5ug/kg降为8.2ug/kg，降解率达到87.1%。说明泰山枯草芽孢杆菌发酵液在实际生产中能高效率的降解霉变饲料中的AFBI。
(六)【具体实施方式】
[0017]实施例1.泰山枯草芽孢杆菌的分离
[0018]采集含淀粉丰富的泰山土壤，80°C的水浴处理I小时，利用稀释涂布法在含淀粉的平板培养基(牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、可溶性淀粉5.0g、琼脂20g和蒸馏水1000ml pH=7.2)上培养1_3天后观察。然后进行初筛与纯化，利用显微镜进行革兰氏染色鉴定，确定是否为枯草芽孢杆菌。再复筛，测定其淀粉酶活性，最后确定菌株。
[0019]实验流程:倒平板_制备梯度稀释液_涂布_培养_初筛_复筛_纯化_保存
[0020]( I)制备土壤稀释液
[0021]取泰山天外村花坛附近土样,去除表层5cm,取5_15cm处。用无菌器具采样100g,装入无菌塑料袋中扎好，记录采样时间地点。将土样与无菌水充分混合，振摇20min,80°C水浴I小时后取出。无菌吸取Iml 土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中，充分混匀,制成?ο-1稀释度的土壤溶液；以此类推，利用上述方法再分别制成10_2、10_3、10_4、10_5不同稀释度的土壤溶液。
[0022](2)涂布
[0023]无菌吸取10_3、10_4、10_5三个梯度土壤液各0.2ml滴在所述的含淀粉的平板培养基中央。用无菌涂布器涂布。
[0024](3)培养
[0025]将淀粉培养基平板倒置于30度培养箱中培养1-3天。
[0026](4)初筛
[0027]观察菌落形态，与标准菌株比对，去除非目的菌株；进行革兰氏染色，显微镜下观察；进行淀粉酶、MR-VP生化试验，最终得到9株菌株。
[0028](5)复筛
[0029]分别挑取初筛出的9株菌株(分别编号为:泰山001、泰山002、泰山003、泰山004、泰山005、泰山006、泰山007、泰山008和泰山009)的单菌落于50ml BPY液体培养基(牛肉提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、葡萄糖5g、酵母浸粉5g和蒸馏水lL，pH=7.0)培养8h后，将此菌液以6%接种量接种于100mlBPY液体培养基中，在37°C、180r/min条件下振荡培养2处后，取80(^1发酵液，加入200 μ I黄曲霉毒素BI (500 μ g/kg)，在37°C黑暗的培养箱中反应72h，以上为处理组；以等量的BPY液体培养基加黄曲霉毒素BI为对照组。采用高效液相色谱HPLC法测定黄曲霉毒素含量。
[0030]黄曲霉毒素 含量测定可分为3个步骤:萃取、净化、检测。首先使用甲醇:水(V:V=6:4)溶液对黄曲霉毒素AFBl进行萃取，然后使用免疫亲和柱对样品残留毒素进行净化提取(方法参照免疫亲和柱使用说明书)；最后用HPLC(柱后光化学衍生)对净化提取得到的样品进行检测。
[0031]HPLC检测条件为流动相甲醇:水=47:53 ；流速lml/min ;色谱柱C18250mmX4.6mm,0.5ym ;激发波长 365nm，检测波长 440nm ;进样量 20ul。
[0032]AFBl降解率(%)=([(对照组AFBl含量-处理组AFBl含量)/对照组AFBl含fi] XlOOo
[0033]结果发现四株菌株对黄曲霉毒素BI (AFBl)具有降解能力，其中一株编号为泰山006的降解能力最强，达到90.12%，将其命名为泰山枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；于2013年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo 8186。
[0034]实施例2.泰山枯草芽孢杆菌的鉴定
[0035](I)泰山枯草芽孢杆菌在BPY琼脂平板(牛肉提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、葡萄糖5g、酵母浸粉5g、，琼脂15g和蒸馏水lL，pH=7.0)上，37°C培养48h后，经光学显微镜观察其形状结构。
[0036](2) 16S rDNA序列的PCR扩增弓丨物设计
[0037]Eubac27F:AGA GTT TGA TCC TGC CTC AG;
[0038]Eubac1492R:GGA TAC CTT GTT ACG ACT T
[0039](3)PCR 反应体系:10XPCR 缓冲液(含 20mmol/L 的 Mg2+) 5 μ 1，20umol/L dNTP4 μ I, 0.10D/ml 引物各 I μ 1，5u/ μ I Taq 酶 I μ I, ddH2033 μ I,总 DNA 模板 50 μ I。
[0040]反应条件:94°C变性 5min;94°C 变性 Imin, 48.2°C 退火 lmin, 72°C 延伸 2min, 35 个循环；72°C延伸lOmin。反应结束后，取5ul PCR产物于1%琼脂凝胶中电泳，PCR产物经回收纯化后连入PGM2T载体，转化大肠杆菌DH5 α细胞。选择转化的阳性克隆提取质粒，由上海生物工程公司完成测序,通过NCBI数据库搜索证明其与枯草芽孢杆菌同源性达到99.8%，结合其形态和生理生化特征指标，将其鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为泰山枯草芽孢杆菌。
[0041]实施例3.泰山枯草芽孢杆菌降解黄曲霉毒素活性组分的确定[0042]挑取泰山枯草芽孢杆菌于50ml BPY液体培养基培养8h后，以6%接种量将此菌液接种于100mlBPY液体培养基中，在37°C、180r/min条件下摇瓶培养24h制得枯草芽孢杆菌发酵液。取5ml发酵液，4°C离心20min (8000r/min)，分离上清液与菌体，上清液于4°C备用；离心后的菌体用蒸馏水洗涤，再离心，取菌体加入5ml蒸馏水制得菌悬液备用；再取5ml发酵液，4°C离心20min(8000r/min)，分离上清液与菌体，取菌体加入5ml蒸馏水，进行细胞超声波破碎后冷冻离心，将离心后的上清液用0.22 μ m大小孔径的过滤膜抽滤，制得胞内液备用。分别取800 μ I枯草芽孢杆菌上清液、菌悬液、胞内液，各加入200 μ I黄曲霉毒素BI (500 μ g/kg)，在37°C黑暗的培养箱中反应72h ；以等量的BPY液体培养基加黄曲霉毒素BI为对照组用HPLC及柱后光化学衍生的方法对AFBl的降解率进行测定。
[0043]测定结果如图1:上清液降解AFBl能力最强，降解率达到81.2%，菌悬液的降解能力次之，降解率为16.10%，胞内液的降解能力最差，降解率为2.31%，基本无降解能力。因此泰山枯草芽孢杆菌对黄曲霉毒素降解的活性物质是一种胞外分泌物，主要存在于其发酵后的上清液中。
[0044]实施例4.泰山枯草芽孢杆菌发酵液活性组分性质的研究
[0045]分别取实施例3中制备的泰山枯草芽孢杆菌发酵上清液各10ml，分别进行热处理(100°C加热30min)和蛋白酶K (0.01g/ml蛋白酶K与发酵上清液反应2h，以未处理的发酵上清液作对照，用高效液相色谱HPLC及柱后光化学衍生的方法对AFBl的降解率进行测定。
[0046]结果如图2所示:发酵上清液经过高温、蛋白酶K处理后，对黄曲霉毒素BI的降解能力明显降低，分别为20%和35% ;而对照组未处理的发酵上清液对AFBl的降解率为74% ；因此可初步判断泰山枯草芽孢杆菌降解AFBl起作用的主要是胞外提取液中的一种生物活性酶，对AFBl的降解过程实质上应是降解酶的酶促反应。
[0047]实施例5.泰山枯草芽孢杆菌的应用
[0048]1.急性毒性试验
[0049]每次每只小鼠最大给药量0.2mL/g, Id经口灌胃给药3次，经观察灌服泰山枯草芽孢杆菌发酵液的小鼠，24h后无死亡现象，也未出现任何明显的中毒现象。3d后处死小鼠，解剖观察其心、肝、脾、肺、肾，均无特殊改变。可见泰山枯草芽孢杆菌对小鼠并无明显的急性毒副作用.[0050]2.泰山枯草芽孢杆菌发酵液对发霉饲料的作用
[0051]取泰山枯草芽孢杆菌发酵液5mL和20g发霉饲料混匀在37°C的培养箱中培养3d，每隔半天充分混匀一次。分别检测发霉饲料处理前和经枯草芽孢杆菌发酵液处理3d后AFBl的含量。结果表明，经泰山枯草芽孢杆菌发酵液处理后霉变饲料中AFBl含量由63.5ug/kg降为8.2ug/kg,远低于黄曲霉毒素的国家限量标准，降解率达到87.1%。因此泰山枯草芽孢杆菌发酵液在实际 生产中能高效率降解霉变饲料中的AFBl。见图3。
【权利要求】
1.一株保藏号为CGMCC N0.8186的泰山枯草芽孢杆菌，已于2013年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；其16srDNA如SEQ.N0.1所示。
2.如权利 要求1所述的泰山枯草芽孢杆菌降解黄曲霉素B1的应用。
【文档编号】C12R1/125GK103820353SQ201310553820
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】柴同杰, 孙玲玉 申请人:山东农业大学