肺转移率比较。
[0025]图7 为生理盐水、NC-siRNA、survivin-siRNA, VEGF-C-siRNA 以及二者组合物治疗乳腺癌移植瘤6次以后的瘤体积比较示意图。
[0026]图8 为生理盐水、NC-siRNA、survivin-siRNA, VEGF-C-siRNA 以及二者组合物治疗乳腺癌移植瘤6次以后瘤重柱形图。
【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
[0028]实施例1.革巴向小鼠VEGF-C与survivin的siRNA的设计与合成本发明中所述靶向VEGF-C的siRNA序列(以下皆简称siVC)，
正义链为:5' -GCAAGACGUUGUUUGAAAUtt-3' (SEQ ID N0.1 )；
反义链为:5' -AUUUCAAACAACGUCUUGCtt-3' (SEQ ID N0.2)；
本发明中祀向survivin的siRNA序列(以下皆简称siSV), 正义链为 5' -GGAAUUGGAAGGCUGGGAAtt-3' ( SEQ ID N0.3 )；
反义链为 5' -UUCCCAGCCUUCCAAUUCCtt-3' (SEQ ID N0.4)。
[0029]以上两种siRNA序列的获得均通过以下方法:首先在NCBI网站的Genbank中获取小鼠 VEGF-C mRNA 的全长序列(GenBank access1n N0.NM_009506)以及小鼠 survivinmRNA 的全长序列(GenBank access1n N0.NM_009689),然后将其分别输入 invitrogen 公司的在线设计软件进行靶向siRNA设计以及BLAST同源基因序列比对排除。
[0030]本发明中以随机序列作为阴性对照(NC)，NC序列(以下皆简称siNC)，
正义链序列为:5' -UUGAUGUGUUUAGUCGCUAtt-3' (SEQ ID N0.5),
反义链序列为:5' -UAGCGACUAAACACAUCAAtt-3' (SEQ ID N0.6) ?
[0031]所述寡聚核酸和NC序列中的A、G、C、U、t表示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，T表示胸腺嘧啶脱氧核苷酸。
[0032]所述寡聚核酸和NC委托上海吉玛(GenePharma)制药技术有限公司合成。
[0033]实施例2:依据所述siRNA分子不同配比的混合物转染后抑制肿瘤细胞增殖与迁徙效果进行优选。
[0034]一种siRNA双干扰组合物，包括寡聚核酸VEGF-C-siRNA分子和寡聚核酸survivin-siRNA分子；所述寡聚核酸VEGF-C-siRNA分子的核苷酸序列，正义链为SEQ IDN0.1，反义链为SEQ ID N0.2 ;所述寡聚核酸survivin-siRNA分子的核苷酸序列，正义链为SEQ ID N0.3，反义链为SEQ ID N0.4。所述寡聚核酸VEGF-C-siRNA分子和寡聚核酸survivin-siRNA分子按照物质量比混合。
[0035]MTT法的步骤为:将对数生长期4T1细胞用含有0.02% EDTA的0.25%胰酶进行消化，用含10%胎牛血清的DMEM溶液吹打成单细胞悬液，调整细胞浓度后接种于96孔板中，每孔细胞数3 X 13个，每孔体积为200μ1，之后放置于饱和湿度5% CO2浓度条件下的37°C恒温孵箱中进行培养。继续培养24 h后，吸出旧培养液，更换不含血清的新DMEM培养液，依照实例3所述方法，实验组加入siRNA终浓度为ΙΟΟηΜ，质量浓度比例分别为O:2 ；0.5:2 ；1:2 ；1.5:2 ；2:2 ；2:1.5 ；2:1 ；2:0.5 ;的 siSV 与 siVC 小干扰 RNA 及对应脂质体，同时设立空白对照组及阴性对照组(终浓度为10nM的siNC及对应脂质体)，每孔体积为200μ1，每组设5个复孔。将96孔板移入CO2孵箱中6小时后取出弃上清，加入新的完全培养基后继续培养，于转染后48h时间点进行MTT检测。每孔加MTT (5mg/mL) 20mL,于37°C恒温孵箱中继续孵育4h后终止培养，弃上清液后每孔加入DMSO 10mL,振荡10分钟使结晶充分溶解，最后应用全自动酶标仪检测490nm波长处各孔的吸光度(0D)。进行数据统计分析，实验重复三次。
[0036]细胞划痕实验的步骤为:实验前先用Marker笔沿着直尺在六孔板下面每孔画一条横线，然后再与之垂直交叉画五条纵线，每两条线间隔距离为0.5cm。将对数生长期4T1细胞用含有0.02% EDTA的0.25%胰酶进行消化，用含10%胎牛血清的DMEM溶液吹打成单细胞悬液，调整细胞浓度后接种于以上画好刻度的6孔板中，每孔细胞数I X 15个，每孔培养基体积为2mL，之后放置于饱和湿度5% CO2浓度条件下的37°C恒温孵箱中进行培养。继续培养24 h后，吸出旧培养液，用20mL枪头对比六孔板后画的直线，每孔垂直划5道痕。之后吸出旧培养液，每孔加入PBS摇晃冲洗3次，清除划道上的细胞，更换不含血清的新DMEM培养液。依照实例3所述方法，实验组加入siRNA终浓度为ΙΟΟηΜ，物质量浓度比例分别为O:2 ；0.5:2 ；1:2 ；1.5:2 ；2:2 ；2:1.5 ；2:1 ；2:0.5 ;的 siSV 与 siVC 小干扰 RNA 及对应脂质体，同时设立空白对照组及阴性对照组(终浓度为10nM的siNC及对应脂质体)，每孔体积为lmL。然后将6孔板移入COJ?箱中，37 °C，5% CO 2条件继续培养，并于6小时后，弃上清，加入无血清，无抗生素的新培养基继续培养。于转染后24小时取出培养板拍照，拍照视野为孔中一固定的划痕与背面黑线交点处，应用IPP6.0软件计算划痕间距宽度以及细胞迁移距离(细胞迁移距离=0小时划痕间距宽度-24小时划痕间距宽度)。
[0037]如图1所示，与转染寡聚核酸的阴性对照组(图中简称siNC)比较，不同比例组合组中小鼠乳腺癌细胞株4T1肿瘤细胞增殖均受到显著抑制(p〈0.5);当siVC与siSV的配比> (2:2)时组合组增殖细胞的吸光度值与单独siSV转染组无显著差异(p>0.5)，当siVC与siSV的配比〈(2:2)时组合组增殖细胞的吸光度值与单独siSV转染组有显著差异(ρ〈0.5)。
[0038]如图2所示，与转染寡聚核酸的阴性对照组(图中简称siNC)比较，不同比例组合组中小鼠乳腺癌细胞株4Τ1肿瘤细胞的迁移均受到显著抑制(ρ〈0.5)，而当siSV与siVC的配比〈(2:2)时组合组增殖细胞的迁移距离与单独siVC转染组有显著差异(ρ〈0.5)，当siVC与siSV的配比彡(2:2)时组合组增殖细胞的吸光度值与单独siSV转染组无显著差异(ρ>0.5)。
[0039]如图3所示，将各实验组所得数据值除以Blank空白对照组数据值所得比值绘制成曲线图，不同配比的siRNA组合物转染对肿瘤细胞增殖率与迁徙率的影响效果并不同步，两条曲线的交集在配比为(2:2)组附近。
[0040]本实施例中，各组合组中小鼠乳腺癌细胞株4T1细胞的增殖与迁移均显著降低，但siSV转染肿瘤细胞的增殖抑制效果更为明显，而siVC转染对于肿瘤细胞的迁移抑制效果更为显著，由此可见，针对于增殖活性与迁移能力不同的肿瘤细胞，或者肿瘤发展的不同阶段，有侧重性的调整siVC与siSV的配比进行组合转染治疗，因该会产生更加优异的疗效。
[0041]本实例为兼顾组合物对于肿瘤细胞增殖与迁移的抑制效果，优选SiVC与siSV比例为(2:2)作为后续应用。
[0042]实施例3.RT-PCR方法检测siRNA转染对肿瘤细胞VEGF-C与survivin的mRNA表达影响。
[0043]使用北京普利来公司的Hifectin II真核细胞转染试剂进行转染，所有操作均按北京普利来公司提供的操作规程。将小鼠乳腺癌4T1细胞接种到6孔板中(IXlO5个细胞/孔)，用含10%胎牛血清的DMEM养液(购自Hyclone)培养16-24小时后，吸出旧培养液，更换为不含血清与抗生素的新DMEM培养液1500 μ L。将寡聚核酸粉末(siVC，siSV及siNC)分别溶解于无RNA酶的无菌水中，配成终浓度为20 μ mol/L的寡聚核酸溶液。
[0044]分别将1yL寡聚核酸溶液(上述siVC, siSV及siNC)和5 μ L的Hifectin I分别稀释于250 μ L无血清培养培养液(DMEM)中，并在室温下孵育5分钟，然后将上述寡聚核酸溶液与Hifectin II溶液混合，复合物于室温静置20分钟后，按如下分组把寡聚核酸-脂质体复合物加到细胞培养板中(细胞生长融合率为50-70% )，使每组转染的寡聚核酸终浓度为10nM: 1.Blank组(500 μ L DMEM培养基/孔)；2.NC组(500 μ L NC-脂质体复合物/孔)；3.siVC组(500 μ L siVC-脂质体复合物/孔)；4.815￥组(50(^1^ siSV-脂质体复合