利用CRISPR-Cas9系统敲除动物FGF5基因的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物基因工程和遗传修饰领域，具体地说，涉及一种利用CRISPR_Cas9 表达系统敲除动物FGF5基因的方法。
【背景技术】
[0002] 自上世纪80年代基因工程兴起以来，大量基因编辑技术出现以满足科研需要，其 中的基因打靶技术是一种在高等动物中对基因进行定点精细修饰的技术。传统基因打靶技 术依赖体内自发的同源重组（HR,homologousrecombination)，效率大约只有1/106。近年 来为了解决同源重组效率低下的问题，人们通过人工构建的杂合分子对特定的DNA序列进 行切割，以此来提高基因打靶的效率，其中以核酸内切酶为核心的人工复合分子最受关注。
[0003] FGF5基因是成纤维细胞生长因子家族的成员。FGF5基因突变型的小鼠和兔子据 有被毛变长的表型，且与野生型相比较无其他性状的差异。研宄已证明FGF5引起被毛变长 是由于其影响毛囊周期性活动，通过使毛囊生长IV期延长，从而导致被毛较野生型更长。 因而FGF5基因突变在产毛类动物上具有很大的实用价值，且并不会影响动物的其他性状 及产品质量。在大型产毛类哺乳动物如绵羊、山羊等物种中进行传统的基因打靶，其效率很 低，为此有必要寻找更好的基因打靶技术进行应用性生产。
[0004] CRISPR/Cas9系统包括一个具备DNA结合和切割的Cas9蛋白以及负责特异性识别 DNA序列并引导Cas9蛋白特异性结合到目的DNA位点的sgRNA。在动物体内，Cas9蛋白与 sgRNA首先结合成一个蛋白复合体，然后通过sgRNA的特异性识别作用，在基因组中识别到 特定的目标DNA序列并一到蛋白复合体结合到DNA链上。然后通过Cas9的核酸内切酶活 性在目标位点将DNA切开，形成一个DNA双链断裂（DSB)。通过诱导自体的DNA修复机制发 挥作用，如同源重组或非同源末端连接（NHEJ，Non-homologousendjoining)，从而在该位 点产生基因突变，从而到达基因打靶的目的。
[0005] 与传统的同源重组介导的基因打靶相比较，利用CRISPR/Cas9系统对哺乳动物进 行基因打靶具有操作简便，效率高，适用物种广泛等优点，尤其可以一次性的实现多基因打 靶，这在动物遗传修饰及疾病模型研宄中都有极其广阔的应用前景。
[0006] 传统的基因打靶技术依赖生物体内自发的同源重组现象，因而效率很低，随着技 术发展后来便出现了锌指核酸酶（ZFNs，zincfingernucleases)和转录激活子样效应子 介导核酸酶（TALENs，transcriptionactivator-likeeffectornucleases)。这两种系统 结构比较相似，每个蛋白分子都是由Folkl核酸内切酶结构域和DNA识别结构域两部分构 成，通过每个蛋白分子中的特异性DNA识别域识别基因组中的特定目的序列，从而将Folkl 内切酶定位至靶位点。由于Folkl核酸内切酶需要在DNA双链上形成二聚体形式才能发挥 核酸内切酶的功能，因而ZFNs和TALENs在基因打靶时都需要两个分子分别定位在靶位点 的两条DNA链上，才可以发挥核酸内切酶的作用，对DNA进行切割产生双链断裂（DSB).
[0007] 虽然ZFNs和TALENs相比于传统的同源重组具有打靶效率高的优点，但是它们依 然存在很多的缺陷，主要包括：1、ZFNs和TALENs的DNA切割结构域均为Folkl，它必须以二 聚体形式发挥作用，因而对哺乳动物进行基因打靶时至少要采用两个DNA表达结构，这在 细胞转染时会对转染效率有更高的要求；2、ZFNs的设计和生产相对复杂，成本较高，应用 于大量的哺乳动物基因打靶时成本难以控制在可以承受的范围；3、ZFNs和TALENs的DNA 识别规则和设计要求较为严格，可能出现靶基因序列中无法找到合适的ZFNs、TALENs识别 区，从而无法应用其进行基因打靶的情况；4、针对不同基因或者不同物种的同一基因进行 基因打靶时，都需要从新设计和构建新的ZFNs、TALENs表达质粒或mRNA，操作繁复；5、ZFNs 和TALENs在进行多基因打靶时，受载体和mRNA分子大小的限制，很难获得较高的打靶效 率。目前未见CRISPR-Cas9表达系统敲除动物FGF5基因的报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种CRISPR-Cas9表达系统敲除动物FGF5基因的方法。
[0009] 本发明的另一个目的是提供特异性靶向FGF5基因的sgRNA。
[0010] 本发明首先比对了不同物种（人类，小鼠，猪，牛，绵羊，山羊）的FGF5基因序列， 从中找到了一个相对保守的区域，在这个区域中进行sgRNA的设计并获得了一条sgRNA的 序列信息。其中特异性靶向FGF5基因第二外显子的sgRNA，其DNA序列如SEQ ID NO. 1所 示。本发明提供了该特异性靶向FGF5基因第二外显子的sgRNA在敲除动物FGF5基因中的 应用。
[0011] 本发明还提供了含有上述sgRNA的DNA序列的载体。
[0012] 在本发明的实施例中，提供的上述载体为PX330-F2。
[0013] 具体地，PX330-F2的构建方法为：（1)设计并合成分别识别FGF5第二外显子的 sgRNA识别区DNA序列，如SEQIDNO. 1所示；（2)合成后的sgRNA序列进行磷酸化后梯度降 温退火，具体步骤为将合成的oligoDNA与10XT4LigationBuffer和T4PNK以2:2:1的比 例混合后再加入3倍体积的水补齐体系，然后37°C孵育30min，再95°C5min变性，之后在以 5°C每分钟的速率降温至25°C完成反应以产生磷酸化粘性末端，同时Bbsl酶切载体pX330 产生粘性末端；（3)以T4连接酶将这两个片段与pX330进行连接，获得真核CRISPR-Cas9表 达系统载体PX330-F2。
[0014] 本发明还提供了体外转录载体PIVT-F2-T载体。
[0015] 所述体外转录载体PIVT-F2-T的构建方法为：设计含有17启动子的上游引物，序 列如SEQIDNO.2所示和与其匹配的下游引物，序列如SEQIDNO.3所示，以载体pX330-F2 为模板PCR扩增获得可以用于体外转录的IVT-F2片段，再以TA克隆的方式将该片段插入 PMD18-T载体中，获得用于体外转录的载体pIVT-F2-T。
[0016] 本发明提供了用于敲除动物FGF5基因的CRISPR_Cas9表达系统，含有特异性靶向 FGF5基因第二外显子的sgRNA的表达载体和Cas9蛋白的体外转录载体。
[0017] 本发明的实施例中，所述含有特异性靶向FGF5基因第二外显子的sgRNA的表达载 体为pIVT-载体pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9F2-T，Cas9 蛋白的体外转录载体为 pCas9_puro3〇
[0018] 其中，pCas9_puro3是通过以下方法构建得到的：（1)以内切酶Agel和Notl酶切 载体pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 获得pX330 载体中的Cas9 表达区段；（2)以Agel 和Notl线性化载体pIRES-pur〇3 ;(3)将将步骤（1)的Cas9表达区段与步骤（2)的线性化 载体pIRES-puro3进行连接获得终载体pCas9-puro3。
[0019] 本发明提供了利用CRISPR-Cas9表达系统敲除动物FGF5基因的方法，包括以下步 骤：
[0020] (1)构建特异性靶向FGF5基因第二外显子的sgRNA的表达载体；通过体外转录表 达得到FGF5基因第二外显子sgRNA;
[0021] (2)构建Cas9蛋白的体外转录载体，得到Cas9mRNA;
[0022] (3)将步骤（1)的sgRNA和步骤⑵的Cas9mRNA纯化后，混合，注射入动物受精 卵细胞质或细胞核中，经体外短时培养后移植入同种雌性动物输卵管中，或体外培养至囊 胚期再移植到同种雌性动物子宫中，以生产敲除FGF5基因的动物。所述体外短时培养是指 30min?48h的培养。
[0023] 本发明方法中，步骤（1)特异性靶向FGF5基因第二外显子的sgRNA的表达载体为 PIVT-F2-T载体。步骤（2)的Cas9蛋白的体外转录载体为pCas9-puro3。
[0024] 步骤（1)和⑵转录产生的mRNA进行吸附柱纯化，将纯化后的mRNA利用分光光 度计测定浓度。
[0025] 步骤（3)中，sgRNA与Cas9mRNA混合后，二者的质量比为1:10?1:2。
[0026] 优选地，二者混合后的质量比为1:7. 5。
[0027] 在本发明的一个实施例中，sgRNA浓度为70ng/y1，Cas9mRNA的浓度为775ng/ U1，使混合后sgRNA和Cas9mRNA终浓度分别为20ng/y1和150ng/y1。
[0028] 本发明还提供了上述方法在制备敲除FGF5基因的动物中的应用。
[0029] 本发明利用CRISPR_Cas9系统进行哺乳动物基因打靶，其优点是：l、sgRNA特异性 识别DNA序列中的NGG三个碱基对，识别规则简单且易分析，在靶基因中可以同时找到多个 sgRNA识别位点，从而可以根据打靶要求进行选择，适用性广泛；2、相比于ZFNs和TALENs 的复杂表达结构，CRISPR-Cas9系统中的Cas9表达结构是固定不变的，针对不同基因只需 要将23bp的识别序列插入sgRNA表达结构中即可完成系统组建，操作简单，成本低，适用于 大规模的哺乳动物基因打靶工作；3、利用CRISPR-Cas9系统继续细胞转染时，由于sgRNA表 达结构很短，所以可以大大提高转染效率，也可以将Cas9和sgRNA表达结构整合到一个载 体中，进一步提高转染效率，这都是ZFNs和TALENs很难做到的；4、针对同一家族的不同基 因或不同物种的同一基因进行基因打靶时，可以选择基因中的保守区进行sgRNA设计，从 而实现同一条sgRNA对多个基因的打靶或修饰，相比其他技术更加简便、高效；5、可以通过 向哺乳动物中同时导入一个Cas9表达结构和多个sgRNA的方式轻松实现多基因同时打靶， 无论从打靶效率还是操作简便程度上都是其他技术无法比拟的。
[0030] 本发明通过构建特异性靶向FGF5基因第二外显子的sgRNA的表达载体和Cas9蛋 白的体外转录载体，获得了靶向FGF5基因第二外显子的sgRNA和Cas9蛋白的mRNA，将其 混合后注入动物受精卵细胞质或细胞核中，经体外短时培