一株过表达gtp 环式水解酶基因的重组高山被孢霉、其构建方法及应用
【专利摘要】本发明涉及一株过表达GTP环式水解酶基因的重组高山被孢霉、其构建方法及应用。本发明构建了四氢生物蝶呤合成途径中GTPCH1基因的过表达工程菌株，以探索BH4在高山被孢霉脂质合成过程中的作用。本发明利用根癌农杆菌介导转化构建了一株过表达GTPCH1基因的重组菌株。重组菌株中GTPCH1基因的相对表达水平提高2倍左右，总脂含量比野生型高山被孢霉提高了约37％，同时NADPH的相对含量提高了2倍左右。这表明GTPCH1在脂质合成过程中具有重要作用，很可能是脂质合成所需NADPH的重要调控因素。此发明为深入解析高山被孢霉脂质合成机理，使之成为生产功能性脂质的细胞工厂提供理论依据。CGMCC No. 1223420160314
【专利说明】一株过表达GTP环式水解酶基因的重组高山被孢霉、其构建 方法及应用 【技术领域】
[0001 ]本发明涉及基因工程领域，特别是一株在过表达GTPCHl基因的高山被孢霉，还涉 及构建方法与用途。 【【背景技术】】
[0002] 多不饱和脂肪酸(PUFAs)是指具有两个或两个以上双键且碳原子数为18-22的直 链脂肪酸。PUFAs为人体健康所必需，它可以治疗和预防心脑血管疾病，促进生长发育，并且 对抗癌、延缓衰老、免疫调节、减肥等均具有重要的生理作用。PUFAs的传统来源主要包括植 物油和深海鱼油，但随着市场对PUFAs需求的日益增长，使得油脂需求量的增加与自然资源 严重短缺的矛盾愈发尖锐，人们开始寻找新的替代资源。与传统的油脂生产工艺相比较，利 用微生物生产油脂具有油脂含量高、生产周期短、生产成本低等优点，因此，开辟微生物油 脂这一新的油脂资源具有重要的现实意义。高山被孢霉油脂合成能力很强，油脂含量可达 细胞干重的50%以上。
[0003] 目前，国内外对高山被孢霉脂质合成机理的研究主要集中在脂肪酸合成途径中相 关酶的功能验证，并由此确定了高山被孢霉PUFAs的代谢通路。已采用的研究手段包括:① 通过物理或化学诱变方法使合成途径中的某个酶失去活性，然后通过分析PUFAs产物推测 其催化底物的能力;②根据相关物种中PUFAs合成途径中酶基因的序列同源性，对目的基因 进行PCR扩增后将其克隆表达至异源宿主菌进行功能验证。
[0004] 乙酰辅酶A和NADPH是脂肪合成的关键因素。乙酰辅酶A是脂肪酸的重要底物和前 体，NADPH是脂肪酸合成的还原力来源。通常认为，磷酸戊糖途径和苹果酸酶是细胞内主要 的NADPH来源。也有研究表明氨基酸代谢和脂质合成有重要关系，如亮氨酸和赖氨酸代谢、 脯氨酸和谷氨酸代谢、丝氨酸代谢、苯丙氨酸代谢等。在高等生物体中，BH 4可能与脂质代谢 有关，包括长链多不饱和脂肪酸的累积和ω-氧化，及不饱和脂肪酸与磷脂的结合。
[0005] 在四氢生物喋呤合成途径中，GTP环式水解酶(GTPCH)是冊4合成的限速步骤。BH4的 从头合成途径是以三磷酸鸟苷(GTP)为底物，首先通过GTPCH的催化生成二氢蝶呤三磷酸盐 (H 2NTP),再通过6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶(PTPS)的作用生成6-丙酮酸四氢生物蝶呤 (PPH4)，并被墨蝶呤还原酶(SR)作用生成BH 4 Jang HC等在前期研究工作中发现，在高山被 孢霉体内，BH4可作为苯丙氨酸羟化酶的必须辅助因子参与苯丙氨酸代谢，可能为脂质合成 提供乙酰辅酶A和NADPH。因此，BH 4很可能是高山被孢霉脂质合成的关键因素。 【
【发明内容】
】
[0006] 本发明的目的是以GTPCHl基因为研究对象，试图获得一株高产脂肪酸的重组高山 被孢霉。特别是以中国专利申请CN 201310347934.8中公开的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷 型菌株MAU1(CCFM501)为宿主菌株，以中国专利申请号CN 201310524221.4中公开的高山被 孢霉重组基因表达系统为基础，通过根癌土壤杆菌介导的方法过表达GTPCHl基因，使得重 组高山被孢霉菌株具有高产脂质的能力，得以将该重组高山被孢霉用于工业生产油脂。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供了一株过表达GTP环式水解酶基因的重组高山被 孢霉(]\1〇1'1:丨6代113 3]^;[1^)]\^661?〇11，该菌株于2016年3月14日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物 研究所，保藏编号为CGMCC No. 12234。
[0008] 根据一种实施方式，本发明的高山被孢霉是用含有GTPCHl基因的根癌农杆菌 C58C1转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株构建而成的。
[0009] 优选地，该菌株是用含有GTPCHl基因的重组质粒pBIG2-ura5s-GTPCHl转化根癌农 杆菌后，再以含转化质粒pBIG2-ura5s-GTPCHl的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养 缺陷型菌株构建而成的。
[0010] 本发明还提供构建上述重组高山被孢霉菌株的方法，包括以下步骤：
[0011] 1)以高山被孢霉cDNA为模板，用引物P1/P2进行PCR扩增，获得编码GTP环式水解酶 的基因 GTPCHl;
[0012] 2)借助高山被孢霉基因操作通用载体pBIG2-ura5s-ITs构建重组质粒pBIG2- ura5s-GTPCHl；
[0013] 3)用构建获得的重组质粒pBIG2-ura5s-GTPCHl转化根癌土壤杆菌；
[0014] 4)用含重组质粒pBIG2-ura5s-GTPCHl的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营 养缺陷型菌株；
[0015] 5)筛选鉴定转化菌株，获得过表达GTPCHl基因的重组高山被孢霉菌株MAeGTPCHl。
[0016] 步骤1)中，引物P1/P2序列如下：
[0017] Pl(Sense):CGGGGTACCGCATGGCAAGCAGCATCGAGAAC
[0018] P2(antisense)：CCGCTCGAGCTAAATCCCACTGCGTCTG
[0019] 根据一种优选的实施方式，上述步骤3)的根癌土壤杆菌为根癌土壤杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)C58Cl〇
[0020] 在本发明中，上述步骤2)的重组质粒pBIG2-ura5s-GTPCHl的构建可参考中国专利 申请CN201310524221.4中公开的内容。根据该申请的记载，首先用PCR的方法从pD4质粒上 获得HPH表达单元，将HPH表达单元用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，插入到EcoRI和XbaI 酶切过的pET28a( + )的多克隆位点(MCS)中，得到质粒pET28a-HPHs。利用PCR从高山被孢霉 cDNA中获得ura5 (乳清酸磷酸核糖转移酶；OPRTase)基因，并利用限制性内切酶BspHI和 BamHI酶切ura5基因，将酶切过的ura5基因插入到NcoI和BamHI酶切过的质粒pET28a-HPHs 中，以替换的hpt基因，构建质粒pET28a-ura5s。用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切质粒 pET28a_ura5s得到ura5s表达单元。将ura5s表达单元替换质粒pBIG2RHPH2中的HPH表达单 元，进一步构建质粒转化质粒pBIG2_ura5s。更进一步地在质粒pBIG2_ura5s和质粒pET28a-HPHs的基础上，构建高山被孢霉基因操作通用载体。用PCR的方法从高山被孢霉基因组中获 得非编码的内含子DNA片段IT。用限制性内切酶Nco I和BamHI分别对IT基因片段和质粒 pET28a-HPHs进行酶切，并通过连接反应将IT片段取代质粒pET28a-HPHs的hpt基因，得到质 粒pET28a-ITs。用限制性内切酶SpeI和XbaI双酶切质粒pET28a-ITs得到ITs表达单元。将 ITs表达单元插入到XbaI酶切过的质粒pBIG2-ura5s中，得到高山被孢霉基因操作通用载体 pBIG2-ura5s-ITs。然后通过基因工程技术将GTPCHl基因插入高山被孢霉通用载体pBIG2- ura5s_ITs中，构建二元表达载体pBIG2_ura5s_GTPCHl。
[0021 ] 上述步骤3)涉及的根癌土壤杆菌为：根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens C58C1(Tsuji G1Fujii S,Fujihara N，et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation for random insertional mutagenesis in Colletotrichum lagenarium[J] .Journal of General Plant Pathology，2003,69(4) :230-239.)，为本领 域技术人员可以公开获得的菌株。在有些文献中，它也被记载为根癌农杆菌C58C1。
[0022]在本发明中，上述步骤4)涉及的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株是重组高山被 孢霉MAUl (在有些文献中也被记载为高山被孢霉CCFM501)，该菌株于2013年11月01日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 8414，该菌株已 在中国专利申请CN 201310347934.8中公开。
[0023] 根据CN 201310347934.8说明书记载，重组高山被孢霉MAU1(即高山被孢霉 CCFM501)是通过失活高山被孢霉(Mortierella alpina)ATCC32222基因组中编码乳清酸磷 酸核糖转移酶OPRTase的ura5基因构建而成的。其中，ura5基因的失活是通过缺失654bp的 ura5基因中的213bp-230bp共18bp的序列而实现的，所使用的同源臂分别是ura5基因上游-1180至+212的1393bp和下游+231至+1592的1362bp的片段，具体步骤为：首先获得ura5敲除 基因片段，并进一步构建敲除质粒pBIG4K0ura5,然后用重组质粒pBIG4K0ura5转化根癌农 杆菌，最后用经转化的含质粒pBIG4K0ura5的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉并对转化后的 高山被孢霉进行筛选和鉴定，获得尿嘧啶营养缺陷型高山被孢霉CCFM501菌株。
[0024]根据一种实施方式，上述步骤5)中筛选鉴定转化菌株的方法包括以下步骤：
[0025] a)以4mL生理盐水来冲刷GY平皿表面，收集孢子液于一个无菌1.5mL离心管中，过 25μι4?| 膜；
[0026] b)用血球计数器计数，调整为三种孢子浓度梯度IO8个每IOOyUlO6个每IOOyUlO 4 个每IOOyU各取200yL涂布于含有lOOyg/mL壮观霉素，100yg/mL头孢噻肟的GY-CS平板上， 25避光培养2-3天；
[0027] c)不定时用无菌镊子挑出生长的真菌菌丝于含有100yg/mL壮观霉素，100yg/mL头 孢噻肟的SC-CS平板上，25 °C培养2-3天；
[0028] d)观察高山被孢霉在平板上的生长情况，挑出在SC-CS平板上生长的菌丝接种于 GY斜面上；
[0029] e)将上述步骤4)中斜面上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上传代三次；
[0030] f)将稳定遗传的菌株鉴定为过表达GTPCHl基因的重组高山被孢霉菌株，保藏于GY 斜面上；
[0031] g)提取含有GTPCHl基因的重组高山被孢霉菌株的基因组DNA，设计一对与启动子 和终止子特异性结合的引物进行PCR验证：
[0032] P3(sense)：CACACACAAACCTCTCTCCCACT
[0033] P4(ant i sense)：CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC；
[0034] h)所述重组菌株保藏于GY斜面上。
[0035] 本发明还涉及上述过表达GTPCHl基因的重组高山被孢霉菌株MAeGTPCHl或利用上 述方法得到的重组高山被孢霉在生产脂肪酸中的用途。
[0036]本发明在现有的高山被孢霉转化系统的基础上，利用根癌土壤杆菌介导的基因转 化方法，构建了在高山被孢霉中过表达GTPCHl基因的工程菌株。所得基因工程菌株经过多 次传代，经验证GTPCHl基因片段仍稳定存在基因组中，且重组菌的生长特性与野生型菌株 无明显差别，重组菌株的脂肪酸含量能够明显得到提高，其总脂含量比野生型高山被孢霉 提高了约37%，为高山被孢霉工业化生产脂肪酸提供了基础和依据。
[0037]本发明的重组高山被孢霉菌株MAeGTPCHl于2016年3月14日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微 生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 12234。 【【附图说明】】
[0038] 图1为二元表达载体pBIG2-ura5s-GTPCHl的构建示意图；
[0039]图2为过表达GTPCHl基因的高山被孢霉重组菌株鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；
[0040] 其中，M为11^迚66~为高山被孢霉野生型对照菌株，1为?8162-11抑58-6了?011转化 的重组菌株。
[0041]图3为高山被孢霉野生型菌株与过表达重组菌株GTPCHl基因 RT-qPCR的结果分析 图；
[0042] 图4为重组菌株MA-GTPCH1与高山被孢霉野生型菌株NADPH相对含量；
[0043]图5为重组菌株MA-GTPCH1与高山被孢霉野生型菌株脂肪酸相对组成；
[0044] 其中，M.alpina为野生型对照;MA-GTPCH1为重组菌株。 【【具体实施方式】】
[0045] 以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。
[0046] 在本发明中，如无特殊说明，用于解释浓度的"％"均为重量百分比、"份"均为重量 份。
[0047]在本发明中，涉及以下培养基：
[0048] Broth培养基：20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，lg/L KH2P〇4,0 · 25g/L MgS〇4 · 7H20，10g/L KN03，pH 6.0。
[0049] MM培养基：1.74g/L K2HP〇4，1.37g/L KH2P〇4,0.146g/L NaCl，0.49g/L MgS〇4 · 7H20,0.078g/L CaCl2,0.0025g/L FeS〇4.7H20,0.53g/L(NH4)2S〇4,7.8g/L MES，1.8g/L葡 萄糖，5g/L甘油，pH 6.8。
[0050] IM培养基是在MM培养基的基础上添加了200μΜ的乙酰丁香酮(AS)构成的。
[00511 YEP培养基：10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L氯化钠，余量为水。
[0052]当采用固体培养基时，在原有培养基组成的基础上添加20g/L琼脂。
[0053] SC固体培养基：20g/L葡萄糖，5g/L酵母氮源无氨基酸和硫酸铵，1.7g/L硫酸铵， 60mg/L异亮氨酸，60mg/L亮氨酸，60mg/L苯丙氨酸，50mg/L苏氨酸，40mg/L赖氨酸，30mg/L酪 氨酸，20mg/lJ泉嘌呤，20π^/1精氨酸，20π^/1组氨酸，10mg/L甲硫氨酸，20g/L琼脂，余量为 水，pH 6.8。
[0054] SC-CS培养基是在SC固体培养基的基础上添加浓度为lOOyg/mL壮观霉素奇霉素 (8卩6〇1：；[1101115^；[11)和浓度为10(^8/1111^头抱噻)3亏抗生素(06；1^0丨&1；[111630(1；[11111)。
[0055] GY固体培养基：20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，2g//L硝酸钾，IgAJ粦酸二氢钠， 3g/L七水硫酸镁，20g/L琼脂，余量为水，pH 6.8。
[0056] GY-U培养基是在GY固体培养基的基础上添加0. lg/L的尿嘧啶。
[0057] GY-CS培养基是在GY固体培养基的基础上添加浓度为lOOyg/mL壮观霉素奇霉素 (spectinomycin)和浓度为100yg/mL头抱噻H亏抗生素（CefotaximeSodium)。
[0058] SOC复苏培养基：20g/L胰蛋白胨，5g//L酵母粉，0.5g//L氯化钠，2.5mM氯化钾，IOmM 氯化镁，20mM葡萄糖，余量为水。
[0059] LB固体培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，20g/L琼脂，余量为水。 [0060] 实施例1过表达GTPCHl基因的重组高山被孢霉菌株的构建 [0061 ] 1.1高山被孢霉GTPCHl的克隆
[0062] 根据高山被孢霉（M.alpina)ATCC#32222GTPCHl基因的序列信息（http:// www.ncbi .nlm.nih·gov/nuccore/JF746874,genbank索弓丨号JF746874· I)，设计引物P1、P2， 下划线部分分别为酶切位点KpnI和Xhol，以高山被孢霉cDNA为模板，用引物P1/P2、K0D高保 真聚合酶，进行PCR扩增，得到GTPCHl基因片段（807bp)，其核酸序列及氨基酸序列如 SEQNo .1 和No .2所示。
[0063] PCR 扩增的反应条件为：941€3111丨11，941€3〇8,55 1€3〇8,68°(：1111丨11，30个循环，681€ 5min;再对PCR产物进行纯化，纯化产物用1.2 %的琼脂糖凝胶电泳验证。
[0064] Pl(Sense):CGGGGTACCGCATGGCAAGCAGCATCGAGAAC
[0065] P2(antisense)：CCGCTCGAGCTAAATCCCACTGCGTCTG
[0066] I · 2二元表达载体的构建
[0067] 1.2.1酶切反应
[0068] 首先，用限制性内切酶KpnI过夜酶切基因片段GTPCH1的PCR纯化产物及载体 pBIG2-ura5s-ITs C3KpnI酶切体系（IOOyL)为：2yL KpnI-HF，30yL质粒或PCR产物，IOyL cutsmartBuf f er，58yL 去离子水，37 °C 水浴酶切 12h 〇
[0069] 酶切产物经纯化后，再用内切酶Xho I单酶切，酶切体系为（IOOyL) :2yL Xho 1，30 yL质粒或PCR产物，IOyL cutsmartBuffer，58yL去离子水，37°C水浴酶切12h后纯化。
[0070] 本发明涉及的内切酶缓冲液cut smar t buf f er : 50mM乙酸钾（Po tass ium acetate)，20mM(Tris-乙酸）Tris-acetate，IOmM乙酸儀（Magnesium acetate)，100μg/ml BSA，余量为水，pH 7.9。
[0071] 1.2.2连接反应
[0072] 用T4连接酶将酶切纯化后的基因片段GTPCHl与载体pBIG2-ura5s-ITs连接，4°C下 处理12h，得到重组表达载体为pBIG2-ura5s-GTPCHl。连接体系为（IOyL): IyL目的基因酶切 后片段，3yL载体酶切后片段，IyL连接酶buffer，IyL T4连接酶，4yL无菌水，4°C连接12h。 [0073]重组表达载体电转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，方法如下：
[0074] 1)无菌状态下取IOOyL感受态细胞，加入l-2yL连接产物，吹吸混匀；
[0075] 2)将上述混匀的感受态细胞移入预冷过的电转杯中，避免产生气泡；
[0076] 3)将电转杯放入Bio-Rad电转仪，调到合适预设程序档位，根据仪器说明电转。电 压条件为1.8kv;
[0077] 4)电转后的感受态细胞移入含有ImL SOC复苏培养基的1.5mL无菌离心管中，37 °C，150rpm孵育1小时；
[0078] 5)取200yL涂布含有100yg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板。倒置37 °C培养过夜。
[0079]挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得二元表达载体 pBIG2-ura5s-GTPCHl〇
[0080]其中，二元表达载体pBIG2-ura5s-GTPCHl电击转化根癌土壤杆菌的方法参照转化 大肠杆菌T0P10的方法，得到含有质粒pBIG2-ura5s-GTPCHl的根癌土壤杆菌C58C1。
[0081 ] 1.3根癌土壤杆菌介导转化高山被孢霉CCFM501
[0082]在已有的根癌土壤杆菌转化方法的基础上介导转化高山被孢霉，具体过程如下： [0083] 1)将保存于-80°C的含有质粒pBIG2-ura5s-GTPCHl的根癌土壤杆菌C58C1在含有 100yg/mL利福平和100yg/mL卡那霉素的YEP固体培养基平板上划线。28°C倒置避光培养48 小时；
[0084] 2)挑取单克隆接种至20mL含有lOOyg/mL利福平和lOOyg/mL卡那霉素的液体YEP培 养基中28 °C，200rpm避光培养24-48小时；
[0085] 3)200yL转接于MM培养基中，培养24-48小时；
[0086] 4)转接至頂培养基中，调整菌浓度至OD6qq为0.3。置于28°C，200rpm摇床避光培养 至0D_到1.0左右；
[0087] 5)用500yL灭菌的生理盐水冲刷在GY-U斜面培养1个月以上的高山被孢霉尿嘧啶 营养缺陷性菌株MAU1 (即高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷性菌株CCFM50 1，可参考CN 201310347934.8的专利申请中公开的M.alpina尿嘧啶营养缺陷型菌株），收集孢子，用血球 计数器计数，调整孢子浓度到IO 7个每IOOyL;
[0088] 6)取IOOyL根癌土壤杆菌与IOOyL孢子混合，均匀涂布于铺有玻璃纸的頂固体培养 基上。23 °C避光培养36-48小时；
[0089] 7)将玻璃纸转移到含有lOOyg/mL壮观霉素和lOOyg/mL头孢噻肟抗生素的SC平板 (SC-CS)上。18°C避光培养12h，随后转移至25°C培养；
[0090] 8)持续观察菌落在SC-CS平板上的生长情况，若长出明显菌落，及时用尖头镊子将 菌落外沿挖出（大约2mm 2)，接种于SC-CS平板上，继续正置于25°C培养箱中培养；
[0091] 9)待SC-CS平板上的转化子长出后，挑菌丝转接于SC-CS平板，重复筛选3次，排除 阴性转化子；
[0092] 10)将筛选3次后生长的菌落接种至GY平板，28°C培养至产生大量孢子，保藏在4 cC。
[0093] 1.4高山被孢霉过表达GTPCHl工程菌株筛选和鉴定
[0094] 1)用3mL生理盐水冲刷GY表面，收集液体于一个无菌1.5mL离心管中，过25μηι滤膜；
[0095] 2)用血球计数器计数，调整为三种孢子浓度梯度IO8个每IOOyUlO 6个每IOOyUlO4 个每100yL，分别取200yL涂布于含有lOOyg/mL壮观霉素和lOOyg/mL头孢噻肟的GY-CS平板 上，25 °C避光培养2-3天；
[0096] 3)随时用无菌镊子挑出生长的真菌菌丝SC-CS平板上，25°C培养2-3天；
[0097] 4)观察高山被孢霉在平板上的生长情况，挑出在SC-CS平板上生长的菌丝接种于 GY斜面上；
[0098] 5)将上述步骤4)中平板上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上传代三次；
[0099] 6)将稳定遗传的菌株鉴定为过表达GTPCHl基因的重组高山被孢霉菌株，保藏于GY 斜面上；
[0100] 7)提取鉴定正确的重组高山被孢霉菌株的基因组DNA，用一对与启动子和终止子 特异性结合的引物进行PCR验证：
[0101] P3(sense)：CACACACAAACCTCTCTCCCACT
[0102] P4(ant i sense)：CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC；
[0103] 通过琼脂凝胶电泳分析来鉴定重组菌株，结果如图2。泳道1的两条产物条带分别 为ura5(818bp)和GTPCHl(GTPCH1807bp加载体上164bp共971bp)两个表达单元，电泳结果表 明二元表达载体成功整合到高山被孢霉基因组中。
[0104] 8)所述重组菌株保藏于GY斜面上。
[0105] 实施例2重组菌株MA-GTPCH1中GTPCHl基因转录水平的RT-qPCR检测
[0106] 2.1 RT-qPCR 引物设计
[0107] 根据GTPCHl序列和内参18SrDNA序列设计引物如下：
[0108] P5(sense)：GACGGCCTTAGCTTCCCAAG
[0109] P6(ant i sense)：CGAACTGCCTCTGCAATCCT
[0110] P7(sense)：CTATTGGCGGAGGTCTATTCGT
[0111] P8(ant i sense)：GCACGCATTCGGATAATTGGT
[0112] 2.2高山被孢霉总RNA提取
[0113] I)取约0.1 g菌体于预冷且灭酶研钵中，加液氮充分研磨；
[0114] 2)加入ImL Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)继续研磨成粉末状后，室温溶 解；
[0115] 3)将溶解后液体用无酶枪头吸出约ImL于无酶离心管中，添加200yL三氯甲烷颠倒 混匀，室温放置2min;
[0116] 4)12000rpm，4°C离心15min，吸取上层水相于新的无酶离心管中；
[0117] 5)添加等体积异丙醇，颠倒混勾，室温放置1〇111；[11，12000印111，4<€，离心15111；[11 ;
[0118] 6)用无酶枪头吸去异丙醇；
[0?19] 7)添加 ImL新配75体积％乙醇，12000rpm，4°C，离心15min后，去上清；
[0120] 8)室温放置干燥，用IOOyL无酶水溶解RNA沉淀，-80 °C保存；
[0121] 9)浓度测定:取IyL RNA用Nanodrop 2000测定浓度；
[0122] 10)变性胶电泳检测RNA完整性:取Iyg RNA在1 · 2 %的变性胶(含1 · 5 %甲醛）中电 泳，观察RNA完整性。
[0123] 2.3反转录合成cDNA及RT-qPCR检测
[0124] 取0.5_lyg总RNA为模板，根据PrimeScript RT reagent kit(TaKaRa,Otsu, Shiga,Japan)试剂盒说明进行操作，获得重组菌株的cDNA。使用ABI-Prism 7900sequence detection system(Applied Biosystems,CA)按照SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems ,CA)的说明进行 RT-qPCR 反应。
[0125] 反应体系为20yL，其中含PowerSYBR⑩Green PCRMaster Mix 10yL，引物各lyL， cDNA 2yL，纯水7μΙ^ΡΟ?程序为95°C，10秒，60°C，10秒进行40个循环。18S rDNA作为管家基 因。利用2+Aet)计算基因转录水平倍数变化，其中Δ Δ Ct为Δ Ct(样品)_ Δ Ct(参照）。
[0126] RT-qPCR结果如图3所示，M.alpina为野生型对照，MA-GTPCH1为重组菌株，分别培 养3天和8天;与对照组相比，在分别培养3d和8d后，过表达菌株中的GTPCHl基因的转录水平 是对照菌株的2倍多，说明转化的GTPCHl基因表达原件成功实现了转录及过量表达。
[0127] 实施例3高山被孢霉NADPH提取与检测
[0128] NADPH提取采用NADP/NADPH测定试剂盒(Biovision公司），根据说明书并做细微改 进进行。
[0129] 1)称取0· Ig湿菌体于2mL EP管中，加入ImL NADP/NADPH Extration buffer，组织 破碎仪破碎后，置于冰上lOmin，离心（1000Xg，IOmin);
[0130] 2)转移上清至IOKDa超滤管中，过滤除去酶；
[0131] 3)剩余步骤参考说明书进行；
[0132] 计算出NADPH质量后，结合高山被孢霉酶菌体干湿重比算出NADPH重量/菌体重量 (mg/g)，结果如图4所示，重组菌株MA-GTPCH1中的NADPH水平均高于对照菌株，3天时，重组 菌株MA-GTPCH1的NADPH含量相对野生型高山被孢霉提高了 2.4倍左右，8天为2倍左右。进一 步证明了过量表达的GTPCHl对细胞内的NADPH水平产生了影响。
[0133] 实施例4高山被孢霉脂肪酸提取与检测 [0134] 4 · 1高山被孢霉脂肪酸提取
[0135] 采用盐酸反复冻融破壁的方式，用有机溶剂提取高山被孢霉干菌体中油脂：
[0136] 1)将高山被孢霉野生型菌株与实施例1获得的高山被孢霉过表达GTPCHl重组菌株 MA-GTPCH1接种于broth培养基中，28°C，200r/min摇床培养7天；
[0137] 2)收集菌体后真空冷冻干燥，并称重计算生物量；
[0138] 3)用研钵将菌体研磨成粉末，精确称取50mg菌粉于提脂瓶，加入2mL 4mol/L盐酸；
[0139] 4)80°C水浴lh，-80°C 15min。重复一次且震荡混匀。80°C水浴lh;
[0140] 5)冷却至室温，加入ImL甲醇，震荡混匀；
[0141 ] 6)加入ImL氯仿，震荡IOmin AOOOg离心3min。小心吸取下部氯仿于新提脂瓶中；
[0142] 7)重复步骤(6)两次；
[0143] 8)合并氯仿（约3mL)，加入ImL饱和氯化钠，震荡混匀，3000g离心3分钟。收集氯仿 层于新提脂瓶中。再继续加入ImL氯仿于原瓶，3000g离心3分钟。合并氯仿(约4mL);
[0144] 9)氮吹干燥。
[0145] 4.2脂肪酸组成及含量的测定:方法如下
[0146] 1)分别向上述粗脂中分别加入IOOyL 2.02mg/ml内标C15:0和ImL 10%盐酸甲醇 溶液，60 °C水浴3h，每隔半小时振荡Imin;
[0147] 2)冷却至室温后加入ImL正己烷和ImL饱和NaCl溶液，震荡混匀，4000rpm离心 3min，吸出正己烷层于新瓶；
[0148] 3)再加入ImL正己烧，震荡混勾，4000rpm离心3min，吸出并合并正己烧；
[0149] 4)氮吹干燥后，加入ImL正己烷，混匀后转入气相瓶，得到脂肪酸甲酯溶液；
[0150] 5)脂肪酸甲酯分析采用GC_2010(Shimadzu Co.，Japan)，色谱柱为 DB-Waxetr (301^0.32111111，0.22以111)。氢火焰离子检测器检测，气化室和检测器温度分别为240°(：和260 °C，分流方式进样IyL，分流比10:1，载气为氮气。程序升温:初始温度120°C保持3min，以5 °C/min升到190°C，再以4°C/min升到220°C，保持20min。通过与商业化的脂肪酸甲酯标准品 (37种脂肪酸甲酯混标，Supelco，USA)和加入内标C15:0的质量比较，定性、定量分析样品中 脂肪酸组分。
[0151] 其中总脂肪酸含量用每克干重菌体中总脂肪酸的质量表示。表1是野生型高山被 孢霉与重组菌株MA-GTPCH1脂肪酸的组成。
[0152] 表1高山被孢霉野生型菌株与重组菌株MA-GTPCH1脂肪酸组成比较
[0154] 表1和图5表明，本发明得到的重组菌株MA-GTPCH1实现了GTPCHl基因过量表达， MA-GTPCH1的总脂肪酸含量(TFA)相比野生型高山被孢霉提高了 37%，其中C20:4(花生四烯 酸)产量提高了78%，由此也证明了高山被孢霉脂质合成和BH4合成途径的相关性。对高山 被孢霉分子改造来解析脂质合成机理，为后续工业化生产功能性脂质提供了理论依据。
[0155] 虽然本发明专利已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明。任何熟悉 此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种改动与修饰。因此本发明的保护 范围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一株过表达6了?环式水解酶基因的重组高山被孢霉1^66了?〇11，该菌株于2016年3月 14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 12234。2. 根据权利要求1所述的重组高山被孢霉，其特征在于所述高山被孢霉是用含有 GTPCH1基因的根癌农杆菌C58C1转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株构建而成的。3. 根据权利要求1所述的重组高山被孢霉菌株，其特征在于该菌株是用含有GTPCH1基 因的重组质粒pBIG2-ura5s-GTPCHl转化根癌农杆菌后，再以含转化质粒pBIG2-ura5s-GTPCH1的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株构建而成的。4. 构建权利要求1所述的重组高山被孢霉菌株的方法，包括以下步骤： 1) 以高山被孢霉cDNA为模板，用引物P1/P2进行PCR扩增，获得编码GTP环式水解酶的基 因 GTPCH1; 2) 借助高山被孢霉基因操作通用载体pBIG2-ura5s-ITs构建重组质粒pBIG2-ura5s-GTPCH1； 3) 用构建获得的重组质粒pBIG2-ura5s-GTPCHl转化根癌土壤杆菌； 4) 用含重组质粒pBIG2-ura5s-GTPCHl的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺 陷型菌株； 5) 筛选鉴定转化菌株，获得过表达GTPCH1基因的重组高山被孢霉菌株MAeGTPCHl。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤1)中，引物P1/P2序列如下： Pl(sense)：CGGGGTACCGCATGGCAAGCAGCATCGAGAAC P2(ant i sense):CCGCTCGAGCTAAATCCCACTGCGTCTG。6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤3)的根癌土壤杆菌为根癌土壤杆 菌（Agrobacterium tumefaciens)C58Cl〇7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤4)的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷 型菌株是重组高山被孢霉MAU1，该菌株于2013年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8414。8. 根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述步骤5)中筛选鉴定转化菌株的方 法包括以下步骤： a) 以4mL生理盐水来冲刷GY平皿表面，收集孢子液于一个无菌1.5mL离心管中，过25μηι 滤膜； b) 用血球计数器计数，调整为三种孢子浓度梯度108个每100yL、106个每100yL、10 4个每 l〇〇yL，各取200yL涂布于含有100yg/mL壮观霉素，100yg/mL头孢噻肟的GY-CS平板上，25避 光培养2-3天； c) 不定时用无菌镊子挑出生长的真菌菌丝于含有100yg/mL壮观霉素，100yg/mL头孢噻 肟的SC-CS平板上，25°C培养2-3天； d) 观察高山被孢霉在平板上的生长情况，挑出在SC-CS平板上生长的菌丝接种于GY斜 面上； e) 将上述步骤4)中斜面上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上传代三次； f) 将稳定遗传的菌株鉴定为过表达GTPCH1基因的重组高山被孢霉菌株，保藏于GY斜面 上； g) 提取含有GTPCH1基因的重组高山被孢霉菌株的基因组DNA，设计一对与启动子和终 止子特异性结合的引物进行PCR验证： P3(sense)：CACACACAAACCTCTCTCCCACT P4(ant i sense)：CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC； h) 所述重组菌株保藏于GY斜面上。9.权利要求1-3中任一项权利要求所述的过表达GTPCH1基因的重组高山被孢霉菌株 MAeGTPCHl或利用权利要求4-9中任一项权利要求所述的方法得到的重组高山被孢霉在生 产脂肪酸中的用途。
【文档编号】C12R1/645GK105861339SQ201610427554
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】王鸿超, 陈永泉, 陈海琴, 陈卫, 张陈, 顾震南, 张灏
【申请人】江南大学