专利名称：一种环氧化物水解酶及其制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及通过定点突变得到的环氧化物水解酶。
背景技术：
环氧化物水解酶(印oxide hydrolase, EH, EC 3. 3. 2. 3)是催化环氧化物或其 盐水解为相应邻二醇或其盐的一类酶的总称，催化反应无需任何辅酶、辅基或金属离子的 参与。环氧化物水解酶广泛分布于哺乳动物、植物和微生物中，目前大多数报道都集中在 哺乳动物的环氧化物水解酶中，主要研究它在细胞解毒和重要生物活性物质代谢中的作 用。近年来，微生物来源的环氧化物水解酶由于具有立体专一性好、酶促反应快、产物光学 纯度和得率高、产物分离纯化简单易行等特点，备受人们关注。1998年Archelas等首次 成功地将环氧化物水解酶应用于工业化生产，合成L(+)_酒石酸(Archelas A，Furstoss R. Epoxidehydrolase :new tools for the synthesis of fine organic chemicals. TrendsBiotechnol 1998 ；16 :108—116)。L (+)-酒石酸，又名(2R，3R) _2，3_ 二羟丁烷_1，4_ 二羧酸，是一种天然结构的有 机酸，可用于诸如以下行业在食品行业诸如可作为食品添加剂、增味剂以及食用色素成分 之一；在医药行业诸如用于抗结核药乙胺丁醇的生产，作为不可替代的光学异构体拆分剂； 在化学工业及其它工业，诸如用于印染的防染剂、照相显影剂、金属离子隐蔽剂、电镀、制革 及制镜行业。过去，生产L(+)_酒石酸的主要方法是利用葡萄酒的副产物酒石或罗望子果为原 料经加工制得，或者从酒石中提取，或者以葡萄糖为主要原料通过一步发酵法提取。而通过 含有环氧化物水解酶的微生物转化法是目前L (+)-酒石酸生产的发展方向，其原理如下 以顺丁烯二酸酐为原料经加水得到顺丁烯二酸溶液，再以钨酸或钨酸盐为催化剂使顺丁烯 二酸与过氧化氢反应制得顺式环氧琥珀酸，最后利用微生物环氧化物水解酶将顺式环氧琥 珀酸或其盐水解为L(+)_酒石酸或其盐。目前报道的能生产L(+)_酒石酸的微生物有根瘤菌属(Rhizobium)、假单胞菌 属(Pseudomonas)、诺卡氏菌属(Nocardia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、红球菌属 (Rhodococcus)、无色杆菌属(Achromobacter)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属 (Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)禾口不云力杆菌属(Acinetobacter)0工业生产 中常用的是具有较高酶活性的红球菌属。2007年Liu等首次报道了红球菌Rhodococcus opacusML-0004环氧化物水解酶的基因序列并在原核细胞中表达(请参见Liu ZQ, Li Y， Xu YY, Ping LF, Zheng YG. Cloning, sequencing, and expression of a novelepoxide hydrolase gene from Rhodococcus opacus in Escherichia coli andcharacterization of enzyme. Appl Microbiol Biotechnol 2007 ;74 :99_106)。然而该酶极不稳定，对温度特 别敏感，在35°C保温30min后，酶活力只有原来的60%，40°C保温30min后，活力几乎完全 丧失，这极大限制了生物催化剂的使用效率。因此，如何提高酶的温度稳定性并维持高酶活 性，是目前利用生物转化法生产L(+)-酒石酸急需解决的一个问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的环氧化物水解酶及其制备方法。为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是本发明所述的DNA分子的主体核苷酸序列如SEQ ID NO 9所示。本发明所述的重组载体含有主体核苷酸序列如SEQ ID NO 9所示的DNA分子。本发明所述的宿主细胞含有重组载体，所述重组载体含有主体核苷酸序列如SEQ ID NO 9所示的DNA分子。本发明所述环氧化物水解酶的主体氨基酸序列的第163位的氨基酸为苯丙氨酸， 所述主体氨基酸序列如SEQ ID NO 10所示。进一步地，本发明所述环氧化物水解酶由主体核苷酸序列如SEQ ID NO 9所示的 DNA分子所编码。本发明所述的环氧化物水解酶的制备方法是用苯丙氨酸取代野生型环氧化物水 解酶的主体氨基酸序列第163位的酪氨酸，所述野生型环氧化物水解酶的主体氨基酸序列 如SEQ ID NO 4所示，该野生型环氧化物水解酶由主体核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的 DNA分子所编码。进一步地，本发明所述取代是指将野生型环氧化物水解酶主体氨基酸序列第163 位的酪氨酸定点突变为苯丙氨酸。相对于现有技术，本发明的有益效果在于1.通过定点突变技术，得到一种新的DNA分子，其主体核苷酸序列如SEQ IDNO 9 所示，编码具有如SEQ ID NO :10所示氨基酸序列的突变型环氧化物水解酶。2.通过基因工程技术，得到了一种新的重组载体，其含有主体核苷酸序列如SEQ ID NO 9所示的DNA分子。3.通过基因工程技术，得到了一种新的宿主细胞，其含有重组载体，所述重组载体 含有主体核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示的DNA分子，该宿主细胞可表达突变型环氧化物 水解酶。4.本发明通过定点突变，将野生型环氧化物水解酶主体氨基酸序列第163位的酪 氨酸取代为苯丙氨酸，大大提高了酶的温度稳定性并维持高酶活性。而目前国内外还未见 对环氧化物水解酶定点改造的研究报道。5.通过基因工程技术，得到了一种表达本发明突变型环氧化物水解酶的基因工程 菌，利用该基因工程菌生产L (+)-酒石酸，大大提高了细胞的使用寿命，符合目前工业应用 的要求。 生物材料样品的保藏信息保藏的生物材料样品红球菌(Rhodococcus sp)；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)；保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所(邮编 100101)；保藏日期2006年7月13日；保藏登记号CGMCCNo. 1756
注该红球菌CGMCC1756 (Rhodococcus sp. CGMCC1756)已在 2010 年 1 月 27 日授 权公告的专利号为ZL200710002155. 9的中国专利说明书中记载。
图1为本发明环氧化物水解酶纯化过程的SDS-PAGE图，其中，M:蛋白分子量标准，从上至下依次为116kDa、66. 2kDa、45kDa、35kDa、25kDa、 18.4kDa、14. 4kDa ；A 超声上清液；B =Ni-NTA柱非结合流出液；C:纯化后的蛋白液。图2为温度对野生型和本发明突变型环氧化物水解酶活性影响的对比图。图3为温度对野生型和本发明突变型环氧化物水解酶稳定性影响的对比图。
具体实施例方式在本发明的以下实施例中，有关的检测方法如下(1)酶活测定方法将0. 9ml lmol/L的顺式环氧琥珀酸钠底物(pH 8. 0)于30°C 保温7min后，加入0. Iml酶液并在30°C反应20min，测定反应液中酒石酸的含量。在上述 反应条件下，每分钟产生1 μ mol酒石酸定义为一个酶活单位，以U表示。在上述条件下，每 毫克蛋白所含的酶活单位数定义为比活力，用U/mg表示。(2)酒石酸含量的检测方法取2. 5ml 1 %的偏钒酸铵于25ml的容量瓶中，加适量 的上述反应液后，再加Iml lmol/L的硫酸，用蒸馏水定容至25ml，混勻后测480nm处的吸光 值，并根据制定的标准曲线计算反应液中酒石酸的含量。(3)蛋白浓度的测定方法取5ml考马斯亮蓝染色液(0. Ig考马斯亮蓝溶于50ml 95%乙醇，加入IOOml 85%磷酸，加水定容至1L)，加入适量蛋白液，混勻后测595nm处的吸 光值，并根据制定的标准曲线计算蛋白浓度。(4)对映体过量值的测定方法取0. Iml环氧化物水解酶液加入0. 9ml lmol/L的 顺式环氧琥珀酸钠(PH 8.0)中，30°C反应4h，用蒸馏水将反应液稀释400倍后，用高压液 相色谱(Agilent 1200)检测，并计算L(+)_酒石酸的对映体过量值，其具体检测条件为手 性柱 Astec CLC (150 X 4. 6讓)；进样量 20 μ 1 ；柱温 30 °C ；流动相 3mM CuSO4 (pH 3. 2)；流速 lml/min ；检测波长 254nm。(5) Km和Vmax值的测定方法将等量酶液分别置于终浓度为10mmOl/L、20mmOl/ L、40mmol/L、60mmol/L、80mmol/L、160mmol/L 的顺式环氧琥珀酸钠底物(pH 8.0)中，30°C 反应5min，测定反应液中酒石酸的含量，并用Lineweaver-Burk双倒数法，计算酶的Km和 Vmax值，其单位分别为mmol/L和U/mg。 实施例1 红球菌CGMCC1756环氧化物水解酶基因的获得
将红球菌CGMCC1756接种至种子培养基(1%葡萄糖，0. 5%蛋白胨，0. 5%牛肉膏， 氯化钠，PH7. 5)中，30°C振荡培养24h。用EZ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒(购于Bio Basic Inc.公司)，按照说明书提取红球菌CGMCC1756的基因组DNA。根据美国GenBank数 据库中公开的红球菌ML-0004 (Rhodococcus opacusML-0004)环氧化物水解酶的核苷酸序列(登录号DQ471957)，设计两条引物(即引物1和引物2)，引物1和引物2的核苷酸序列 分别如SEQ ID NO :1和SEQ IDNO :2所示。以提取的红球菌CGMCC1756基因组DNA为模板， 利用引物1和引物2，通过常用的PCR扩增技术获得一段约为SOObp的DNA片段。其PCR反 应体系为双蒸水 40 μ 1，10XPCR buffer 5 μ 1,10mmol/L dNTPs 1 μ 1，1 μ 1 的 lOmmol/L 引物 1，1 μ 1 的 10mmol/L 引物 2，红球菌 CGMCC1756 基因组 DNA 1 μ 1，Taq 酶 1 μ 1，共 50 μ 1 的反应体系。其PCR程序为94°C预热5min后，94°C 50s, 40°C 30s, 72°C lmin，30个循环， 最后72°C延伸lOmin。PCR产物用Wizard PCR片段回收试剂盒(购于Promega公司)回 收纯化后，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA测序。测序结果显示，红球菌 CGMCC1756环氧化物水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 4 所示。实施例2 红球菌CGMCC1756环氧化物水解酶表达体系的构建根据实施例1中对红球菌CGMCC1756环氧化物水解酶基因的测序结果，重新设计 两条引物(即引物3和引物4)，引物3和引物4的核苷酸序列分别如SEQID NO 5和SEQ ID N0:6所示。引物3中带有Nco I限制性内酶切位点、6个多聚组氨酸序列和起始密码 子。引物4中带有Bam HI限制性内酶切位点和终止密码子。以实施例1中提取的红球菌 CGMCC1756基因组DNA为模板，利用引物3和引物4，PCR扩增获得一段约为SOObp的核苷 酸片段。其 PCR 反应体系为双蒸水 40 μ 1，10XPCR buffer 5 μ l,10mmol/L dNTPs 1μ 1, 1 μ 1 的 10mmol/L 引物 3，1 μ 1 的 10mmol/L 引物 4，红球菌 CGMCC1756 基因组 DNA 1 μ 1， Taq酶1 μ 1，共50 μ 1的反应体系。其PCR程序为94°C预热5min后，94°C 50s，55°C 30s， 72°C lmin，30个循环，最后72°C延伸lOmin。将该PCR片段和pTrc99A载体(购于Amersham Biosciences公司)分别用限制性内切酶NcoI和Bam HI于37°C酶切10h。跑琼脂糖凝 胶电泳，用Wizard PCR片段回收试剂盒(购于Promega公司)回收纯化两个目的片段后， 用！； DNA连接酶于16°C连接4h，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞(购于北京 鼎国生物技术有限责任公司，其基因型为recAl，endAl，gyrA96，thi-1, hsdR17，supE44， relAl, Δ (lac-proAB) /F' [traD36, proAB+, laclq, IacZ ΔM15])，涂布于含 50 μ g/ml 氨苄 青霉素的LB琼脂平板上(1%蛋白胨，0. 5%酵母提取物，氯化钠，1. 5%琼脂粉，pH7. 0)， 通过菌落PCR(其PCR反应体系中的模板为1 μ 1菌液，其余PCR反应体系和程序与实施 例1相同)筛选阳性克隆，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果显示， 红球菌CGMCC1756环氧化物水解酶基因成功克隆到pTrc99A载体中，将该重组载体命名为 pTrc99A-EH，该基因工程菌命名为野生型基因工程菌，其表达的蛋白命名为野生型环氧化 物水解酶。所述野生型基因工程菌表达的环氧化物水解酶的氨基酸序列，除了含有SEQ IDNO :4所示的氨基酸序列外，还含有6个组氨酸标签序列。为明确起见，本发明将具有SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列定义为野生型环氧化物水解酶的主体氨基酸序列，将具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列定义为野生型环氧化物水解酶的主体核苷酸序列，6个组氨酸 序列为环氧化物水解酶的标签序列。本发明并不限定任何特定类型的前导序列、标签序列 或信号肽。实施例3 红球菌CGMCC1756环氧化物水解酶基因的定点突变对红球菌CGMCC1756环氧化物水解酶的主体氨基酸序列第163位的酪氨酸(Tyr，对应密码子为TAC)定点突变为苯丙氨酸(Phe，对应密码子为TTC或TTT)。TTC和TTT是同 义密码子，它们均编码苯丙氨酸，本发明以TTC密码子为例，设计突变引物(即引物5和引 物6)，引物5和引物6的核苷酸序列分别如SEQ IDNO 7和SEQ ID NO 8所示。以实施例 2中的重组载体pTrc99A-EH为模板，以引物5和引物6为突变引物进行PCR扩增。其PCR 反应体系为双蒸水 40 μ 1，10XPCR buffer 5 μ 1,10mmol/L dNTPs 1 μ 1，1 μ 1 的 IOmmol/ L 引物 5，1μ 1 的 10mmol/L 引物 6，重组载体 pTrc99A_EH 1 μ 1，Taq 酶 1 μ 1，共 50 μ 1 的反 应体系。其PCR程序为94°C预热5min后，94°C 50s, 66°C 30s, 72°C 6min，30个循环，最后 72°C延伸lOmin。然后将上述PCR产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，在含50 μ g/ml氨 苄青霉素的LB琼脂平板上挑取菌落，通过上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA测 序，筛选阳性克隆。突变后的环氧化物水解酶的主体核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示，其编 码的主体氨基酸序列如SEQ ID N0:10所示。测序结果表明，红球菌CGMCC1756环氧化物水 解酶主体氨基酸序列第163位的Tyr已成功突变为Phe。本发明将突变后的重组载体命名 为pTrc99A-EH-Y163F，该基因工程菌命名为突变型基因工程菌，其表达的蛋白命名为突变 型环氧化物水解酶。在对环氧化物水解酶主体氨基酸序列的163位酪氨酸残基进行取代时，或保留其 核苷酸序列或氨基酸序列的其他位点的野生型，或同时对环氧化物水解酶的核苷酸序列或 氨基酸序列的其他单一位点或多位点进行取代或缺失或添加，都能达到本发明的效果。本发明所述的红球菌CGMCC1756环氧化物水解酶或其突变体DNA分子以合适的取 向和正确的阅读框插入到所述的载体，或者转入所述的宿主细胞中，所述的DNA分子可以 在任何真核或原核系统中表达。许多宿主-载体系统都可以用来表达蛋白质编码序列。本 发明的宿主-载体系统包括但不限于用噬菌体、质粒或粘粒转化的细菌；含有酵母载体的 微生物，如酵母；用病毒感染的哺乳动物细胞系统；用病毒感染的昆虫细胞系统；用细菌感 染的植物细胞系统。本发明优选的载体包括病毒载体、质粒、粘粒或寡核苷酸，更优选的载 体是质粒，例如pTrc99A质粒。本发明优选的宿主为原核细胞，更优选的宿主是大肠杆菌细 胞，例如JM109。本发明所述的红球菌CGMCC1756环氧化物水解酶或其突变体基因可以处于任何 启动子的控制之下，可以选择强原核启动子，也可采用组成型或调节型的酵母启动子。本发 明并不限定任何特定的载体、启动子或终止子。所述的载体也可以带一个选择性标记，通常 是抗生素的抗性基因或者具有代谢缺陷特征的酵母菌株的互补菌种的基因。本发明并不限 定任何特定类型的前导序列、标签序列或信号肽。 实施例4 野生型和突变型环氧化物水解酶的表达和纯化
分别接种实施例2中的野生型基因工程菌和实施例3中的突变型基因工程菌至含 50 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中(1 %蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1 %氯化钠，pH7. 0)， 当菌体浓度(OD6tltl)达到0.4-0. 6时，加入0. 2mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，37°C振荡 培养12h。4°C，5000rpm离心IOmin收集菌体，生理盐水冲洗三次后，按每克菌体5ml的 比例加入裂解缓冲液(50mmol/LTris-HCl，0. 5mol/L NaCl, ρΗ 7. 5)，冰预超声破菌，4°C， SOOOrpm离心30min，取上清液，上样至Ni-NTA亲和柱(购于上海悦克生物科技有限公司)， 用洗杂缓冲液(50mmol/L Tri s-HCl,0. 5mol/L NaCl，20mmol/L 咪唑，ρΗ 7.5)洗去杂质成 份，用洗脱缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，0. 5mol/L NaCl，200mmol/L 咪唑，ρΗ 7.5)洗脱目的蛋白，将收集的酶液于4°C，10mmol/L Tri s-HCl (pH 7. 5)缓冲液中充分透析，聚乙二醇 浓缩后，用含50%甘油的lOmmol/L Tris-HCl (pH7. 5)缓冲液，于_20°C保存，并通过12% 的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis, SDS-PAGE)检测纯化效果，图1的C泳道表明，纯化后的蛋白条带单一， 纯度达99%以上，其分子量约为29kDa。实施例5 野生型和突变型环氧化物水解酶的酶活分析1.温度对野生型和突变型环氧化物水解酶活性和稳定性的影响将实施例4中纯化得到的野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶分别 于 25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C，按照上述检测方法测定野生 型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶的活性。结果显示(参见图2)，野生型环氧化 物水解酶在25-55°C (最高酶活的60%以上)、优选为35-50°C (最高酶活的90%以上) 有较高的活力，其最高比活力为453U/mg。突变型环氧化物水解酶在25-60°C (最高酶活的 60%以上)、优选为40-60°C (最高酶活的80%以上)、更优选为45-55°C (最高酶活的90% 以上)有较高的活力，其最高比活力为462U/mg。突变型环氧化物水解酶的最适温度略高于 野生型环氧化物水解酶，并且突变型环氧化物水解酶的最高比活力也略高于野生型环氧化 物水解酶。将实施例4中纯化得到的野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶分别 于25°C、3(TC、35°C、4(TC、45°C放置30min后，在30°C的条件下，按照上述检测方法测定野 生型和突变型环氧化物水解酶的活性，并根据对照组计算残余活力。对照组实验为野生型 环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶不经过30min保温，直接于30°C测活，对应的酶 活定义为100%。结果显示(参见图3)，野生型环氧化物水解酶在35°C保温30min后，残余 活力为60%，40°C保温30min后，只剩1 %的活力。然而突变型的环氧化物水解酶在35°C保 温30min后，残余活力为76%，40°C保温30min后，还剩52%的活力，远高于野生型环氧化 物水解酶。这说明，突变型环氧化物水解酶的温度稳定性比野生型环氧化物水解酶有显著 提高；本发明所述的突变型环氧化物水解酶，是由含有SEQ ID NO :9的主体核苷酸序列的 重组载体在宿主细胞中表达得到的；本发明的重组载体含有主体核苷酸序列如SEQ ID N0 9所示的DNA分子；本发明的宿主细胞含有重组载体，所述重组载体含有主体核苷酸序列如 SEQ ID NO 9所示的DNA分子。2. pH值对野生型和突变型环氧化物水解酶活性和稳定性的影响将实施例4中纯化得到的野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶分别 于不同酸碱度下，具体为ρΗ 5·0、ρΗ 6·0、ρΗ 7. 0、ρΗ 8. 0、ρΗ 9. 0、ρΗ10. 0，按照上述检测方 法测定野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶的活性。结果显示，在PH 5.0、ρΗ 6.0、ρΗ 10.0的条件下，野生型和突变型环氧化物水解酶活力都很低(最高酶活的20%以 下)；在pH 7. 0-9.0时有较高活力，达到最高酶活的60%以上，优选pH 8. 0-9.0时，达到最 高酶活的80%以上，并且它们的最适宜的pH值都为8. 0。这说明pH对野生型环氧化物水 解酶和突变型环氧化物水解酶活性的影响基本一致。将实施例4中纯化得到的野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶分别 于 pH 5. 0、ρΗ 6. 0、ρΗ 7. 0、ρΗ 8. 0、ρΗ 9. 0、ρΗ 10. 0 及室温下放置 30min 后，于 pH 8. 0 的 条件下，按照上述检测方法测定野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶的活性，并根据对照组计算残余活力。对照组实验为野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水 解酶不经过30min的pH梯度放置，直接于pH 8. 0测活，对应的酶活定义为100 %。结果 显示，野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶在pH 5.0、pH 6.0、pH 10. 0放置 30min后，残余活力均小于20% ；它们在ρΗ 7· 0_9· 0 (残余活力有60 %以上)放置30min 后，仍有较高活力，其中优选为PH 8. 0-9.0 (残余活力有80%以上)，更优选为pH 8. 0 (残 余活力有90%以上)。这说明pH对野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶稳定 性的影响基本一致。3.野生型和突变型环氧化物水解酶的动力学和立体特异性根据上述检测方法，测定实施例4中纯化得到的野生型环氧化物水解酶和突变 型环氧化物水解酶的动力学参数(Km和Vmax)和对映体过量值(反映酶的立体特异性)。 野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶都具有米氏酶的典型特征，Km值分别为 50. 3mmol/L和49. 8mmol/L, Vmax值分别为687. 6U/mg和679. OU/mg，对映体过量值分别为 99. 4%和99. 5%。测定结果表明，野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶的动力 学性质和立体特异性基本一致。实施例6:利用本发明所述的野生型和突变型基因工程菌细胞制备L(+)_酒石酸 或其盐本发明生产L(+)_酒石酸或其盐的方法是在顺式环氧琥珀酸或其盐溶液中，加 入环氧化物水解酶(野生型和/或突变型)和/或基因工程菌(野生型和/或突变型)进 行酶促反应，生成L(+)_酒石酸或其盐。本发明所涉及的顺式环氧琥珀酸盐为顺式环氧琥 珀酸与各种阳离子形成的盐，阳离子包括但不仅限于铵离子、钾离子、钠离子和钙离子等。 以下举例说明分别取Ig实施例4中经异丙基硫代_ β -D-半乳糖苷诱导的野生型和突变型基因 工程菌细胞，于100ml lmol/L顺式环氧琥珀酸二钠溶液中，30°C振荡反应24h，加入CaCl2 水溶液，过滤并水洗沉淀，再经硫酸酸解、阴阳离子交换柱精制、浓缩、结晶和烘干，分别得 到L(+)_酒石酸15. 2g和15. 3g。在转化过程中，我们通过测定半衰期(酶活降低至起始酶 活一半时所需的时间)来检测野生型基因工程菌和突变型基因工程菌的酶活稳定性。野生 型基因工程菌的酶活半衰期为10h，突变型基因工程菌的酶活半衰期为18h。这说明，突变 型基因工程菌的酶活稳定性比野生型基因工程菌有显著提高。本发明所述的突变型基因工 程菌含有重组载体，所述重组载体含有主体核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示的DNA分子，该 主体核苷酸序列编码如SEQ ID NO :10所示的蛋白，该蛋白具有环氧化物水解酶活性。
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权利要求
一种DNA分子，其特征在于其主体核苷酸序列如SEQ ID NO9所示。
2.一种重组载体，其特征在于其含有主体核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示的DNA分子。
3.一种宿主细胞，其特征在于其含有重组载体，所述重组载体含有主体核苷酸序列 如SEQ ID NO 9所示的DNA分子。
4.一种环氧化物水解酶，其特征在于其主体氨基酸序列的第163位的氨基酸为苯丙 氨酸，所述主体氨基酸序列如SEQ ID N0:10所示。
5.根据权利要求4所述的环氧化物水解酶，其特征在于该环氧化物水解酶由主体核 苷酸序列如SEQ ID NO :9所示的DNA分子所编码。
6.一种权利要求4所述的环氧化物水解酶的制备方法，其特征在于用苯丙氨酸取代 野生型环氧化物水解酶的主体氨基酸序列第163位的酪氨酸，所述野生型环氧化物水解酶 的主体氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示，该野生型环氧化物水解酶由主体核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的DNA分子所编码。
7.根据权利要求6所述的环氧化物水解酶的制备方法，其特征在于所述取代是指将 野生型环氧化物水解酶主体氨基酸序列第163位的酪氨酸定点突变为苯丙氨酸。
全文摘要
本发明公开了一种环氧化物水解酶及其制备方法。该环氧化物水解酶的主体氨基酸序列的第163位的氨基酸为苯丙氨酸，其主体氨基酸序列如SEQ IDNO10所示，该环氧化物水解酶由主体核苷酸序列如SEQ ID NO9所示的DNA分子所编码。该环氧化物水解酶的制备方法是用苯丙氨酸取代野生型环氧化物水解酶主体氨基酸序列第163位的酪氨酸，所述野生型环氧化物水解酶的主体氨基酸序列如SEQ ID NO4所示，该野生型环氧化物水解酶由主体核苷酸序列如SEQ ID NO3所示的DNA分子所编码。与野生型环氧化物水解酶相比，本发明环氧化物水解酶具有较高的温度稳定性并维持高酶活性，可用于水解顺式环氧琥珀酸或其盐为L(+)-酒石酸或其盐，提高工业化生产中生物催化剂的使用寿命。
文档编号C12N1/21GK101942471SQ20101025360
公开日2011年1月12日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者张建国, 潘海峰, 谢志鹏, 鲍文娜 申请人:杭州宝晶生物化工有限公司