专利名称：一种荧光假单胞菌da4菌株及其获得方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于荧光假单胞菌菌种及其应用领域，特别涉及一种荧光假单胞菌DA4菌 株及其获得方法和应用。
背景技术：
目前，亚麻工业生产上普遍采用传统的亚麻温水怄麻、雨露怄麻及天然水怄麻等 方法，均利用天然微生物及其酶对亚麻的果胶、半纤维素和木质素等胶质进行降解，菌株混 杂，难以进行有效的控制，导致脱胶时间长(温水怄麻约为4d ；雨露怄麻为15-20d ；天然水 怄麻5-7d)、综合长麻率低、质量不稳定(束纤维强力低)和环境污染重等诸多问题，严重制 约着亚麻产业的大力发展。值得注意的是，亚麻脱胶技术存在的不足使得纤维质量不佳，长 麻率和梳成率较低、强度弱、可纺性差是目前制约亚麻纺织不能纺高支纱和生产高档产品 的关键问题之一。尽管20世纪以来，不同的亚麻脱胶菌种如黑曲霉、真菌等被分离、纯化并 用于亚麻脱胶。虽然将微生物及其产生的酶类应用于亚麻脱胶不仅可以提高纤维的产量和 品质，耗能少、使用安全，可减轻对环境的污染，具有良好的前景，但是其产业化一直未能实 现。荧光假单胞菌在自然界分布很广，在4°C时繁殖速度很快，其是奶类、蛋类在低温条件下 保存导致腐败变质的主要细菌之一。虽然有关于荧光假单胞菌及其发酵培养方法的相关专 利，但是其多用于促进作物生长及植物土传病害防治(CN200510112542.9)而未见其在亚 麻等麻类纤维胶质分解中的应用报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种荧光假单胞菌DA4菌株及其获得方法和 应用，本发明所筛选的荧光假单胞菌菌种繁殖速度快，抗污染能力强，耐热性和耐碱性能 好；采用该复合脱胶酶液进行亚麻脱胶不仅大大缩短了脱胶周期，体系及培养过程操作安 全，无毒性、无环境污染；采用其进行亚麻微生物脱胶可缩短亚麻脱胶周期、提高亚麻纤维 的出麻率、提高亚麻纤维的强度、改善亚麻纤维质量，利于推广。本发明的一种荧光假单胞菌DA4菌株(CGMCC No. 3839)，其特征在于该菌株具有 产果胶酶和半纤维素酶能力，具有亚麻脱胶活性。本发明的一种荧光假单胞菌DA4菌株的获得方法，包括(1)从东海舟山海域取样腐烂海草，先将海草与富集培养基按Ig 20ml的比例于 富集培养基中室温静置培养30天，然后取0. Iml富集培养基涂布于分离培养基，37°C分离 培养1 4天，获得自野生型脱胶优势菌株；其中，富集培养基配方为亚麻粉5g，无菌水200ml，pH自然；分离培养基配方 为亚麻粉 5g，(NH4)2SO4 5g，K2HPO4 lg，MgSO4 0. 5g, KCl 0. 5g, FeSO4 0. 01，琼脂 20g，/K IOOOmL,用NaOH将pH调节到9 ；(2)将步骤(1)中得到的菌株用滤纸片接种到果胶营养培养基中，28°C培养72h， 带菌落形成后，加入0. 2%刚果红水溶液染色4h，倒去表面剩余刚果红溶液，加入少量蒸馏水荡去薄层表面刚果红，对光即可见明显的绛红色水解圈，在菌落周围出现绛红色水解圈 者即为果胶分解菌(测量果胶琼脂平板上菌周围的透明圈直径和菌落直径，水解圈与菌落 直径之比大者一般有较高果胶酶活力)； 然后将果胶分解菌用滤纸片接种到半纤维素营养培养基中，28°C培养72h，即可见 水解圈(测量水解圈和菌苔大小，并计算二者大小之比，水解圈与菌落直径之比大者一般 有较高半纤维素酶活力)；
株。
(3)通过透明圈法从上述培养基中选择出具有产果胶酶和半纤维素酶能力的菌
所述步骤(2)中的果胶营养培养基，其组分包括 果胶2g
NAN033g
K2HP040. 5gMgS04Ig琼脂20g水IOOOmLpH自然，7.0-7. 2。半纤维素营养培养基，其组分包括半纤维素(自制) 2OgNH4N032gK2HP042gMgS040. 2g酵母膏5g琼脂20g水IOOOmLpH7.2。本发明的一种荧光假单胞菌DA4菌株在亚麻脱胶中的应用，包括(1)荧光假单胞菌DA4菌株保存于牛肉膏蛋白胨培养基，37°C 200rpm培养24h，添 加冻存缓冲液；(2)在灭菌冷却后的50mL营养肉汤培养基中，接入上述斜面培养24h的菌一环，在 转速200r/min、温度40°C条件下摇瓶培养24h ；(3)将50ml摇瓶培养后培养基接种入亚麻发酵培养基5L，在转速200r/min、温 度40°C条件下摇瓶培养24h得到发酵菌液；其中，亚麻发酵培养基配方为豆粕5g，KCl 0. 05g，磷酸氢二钾 0. lg, MgSO4 0. 05g，FeSO4 0. OOlg, (NH4)2SO4 0. 5g，补水至 IOOml 定容 (5L发酵培养基等同增加各组分用量)；将发酵菌液于4°C，8000r/min离心，取上清液即为所得酶液，然后经DNS比色法测 定，酶液中果胶酶酶活力为205. 44U/mL，木聚糖酶酶活力为259. 57U/ml，其在pH6. 5-9. 0， 50°C以下酶活较稳定；(4)将灭菌后的亚麻原茎与步骤3所得发酵菌液按浴比1 20混合，在40°C， 200rpm摇床中分别脱胶1 4天，脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min，用自来水冲洗数次以去除亚麻上的细菌，停止脱胶。所述步骤(1)中的冻存缓冲液由磷酸二氢钾0. 0627g，磷酸氢二钾0. 0177g，柠檬 酸钠0. 0588g，七水合硫酸镁0. 02645g，甘油10ml，加水定容至IOOml制得。本发明的一种荧光假单胞菌DA4菌株在亚麻纱线前处理中的应用，包括步骤(1) (3)同上；(4)将灭菌后的亚麻纱线与步骤3所得发酵菌液按浴比1 20混合，在40°C， 200rpm摇床中分别脱胶1 4天，脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min，用自 来水冲洗数次以去除亚麻上的细菌，停止脱胶；其中，亚麻纱线为亚麻粗纱或亚麻二粗。本发明的一种荧光假单胞菌DA4菌株在亚麻织物煮练中的应用，包括步骤(1) (3)同上；(4)将灭菌后的亚麻织物与步骤3所得发酵菌液按浴比1 20混合，在40°C， 200rpm摇床中分别脱胶1 4天，脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min，用自 来水冲洗数次以去除亚麻上的细菌，停止脱胶。该菌株除可以用于黄麻、大麻等韧皮纤维脱胶及其织物前处理外等。提取菌株的DNA进行PCR扩增后进行测序，测定菌株16S rRNA全序列，根据 16sRDNA测序(
图1、图2)Blast及聚类分析结果，本发明所筛选菌株与荧光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens相似性为99 %，结合生理生化试验结果和镜检分析，命名此菌株 为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) DA4菌株，并于2010年5月17日保藏在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，保藏号为CGMCC No. 3839。该菌株具有在适当的培养和发酵条件下，由于其具有高产率产生果胶酶和木聚糖 酶的能力，可以有效去除亚麻中的胶质，实现亚麻微生物深层浸没脱胶。该菌株生物学特征如下(附图1、图2)
权利要求
1.一种荧光假单胞菌DA4菌株(CGMCC No. 3839)，其特征在于该菌株具有产果胶酶和 半纤维素酶能力，具有亚麻脱胶活性；其16S rRNA序列，如下AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAGAGAGAAGCTTGCTTCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAAAGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCTTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGACTGACTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCGCAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC。
2.一种荧光假单胞菌DA4菌株的获得方法，包括(1)从东海舟山海域取样腐烂海草，先将海草与富集培养基按Ig 20ml的比例于富集 培养基中室温静置培养30天，然后取0. Iml富集培养基涂布于分离培养基，37°C静置培养 1 4天，获得自野生型脱胶优势菌株；其中，富集培养基配方为亚麻粉5g，无菌水200ml，pH自然；分离培养基配方为亚麻 粉 5g，(NH4)2SO4 5g，K2HPO4 lg，MgSO4 0. 5g, KCl 0. 5g, FeSO4 0. 01，琼脂 20g，水 lOOOmL，用 NaOH将pH调节至Ij 9 ；(2)将步骤(1)中得到的菌株接种到果胶营养培养基中，28°C培养72h，带菌落形成后， 加入0. 2 %刚果红水溶液染色4h，倒去表面剩余刚果红溶液，加入少量蒸馏水荡去薄层表 面刚果红，对光即可见明显的绛红色水解圈，在菌落周围出现绛红色水解圈者即为果胶分解菌；然后将果胶分解菌接种到半纤维素营养培养基中，28°C培养72h，即可见水解圈； (3)通过透明圈法从上述培养基中选择出具有产果胶酶和半纤维素酶能力的菌株。
3.根据权利要求2所述的一种荧光假单胞菌DA4菌株的获得方法，其特征在于所述 步骤(2)中的果胶营养培养基，其组分包括果胶2gNAN033gK2HP040. 5gMgS04Ig琼脂20g水IOOOmLpH自然，7. 0-7. 2 半纤维素营养培养基，其组分包括 半纤维素(自制) 20gNH4N032gK2HP042gMgS040. 2g酵母膏5g琼脂20g水IOOOmLpH7.2。
4.一种荧光假单胞菌DA4菌株在亚麻原茎脱胶中的应用，包括(1)荧光假单胞菌DA4菌株保存于牛肉膏蛋白胨培养基，37°C200rpm培养24h，添加冻 存缓冲液；(2)在灭菌冷却后的50mL营养肉汤培养基中，接入上述斜面培养24h的菌一环，在转速 200r/min、温度40°C条件下摇瓶培养24h ；(3)将50ml摇瓶培养后培养基接种入亚麻发酵培养基5L，在转速200r/min、温度40°C 条件下摇瓶培养24h得到发酵菌液；其中，亚麻发酵培养基配方为豆粕5g，KCl 0. 05g，磷 酸氢二钾 0. lg, MgSO4 0. 05g，FeSO4 0. OOlg, (NH4)2SO4 0. 5g，补水至 IOOml 定容；(4)将灭菌后的亚麻原茎与步骤3所得发酵菌液按浴比1 20混合，在40°C，200rpm 摇床中分别脱胶1 4天，脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min，用自来水冲洗 数次以去除亚麻上的细菌，停止脱胶。
5.根据权利要求4所述的一种荧光假单胞菌DA4菌株在亚麻脱胶中的应用，其特征在 于所述步骤(1)中的冻存缓冲液由磷酸二氢钾0.0627g，磷酸氢二钾0.0177g，柠檬酸钠 0. 0588g，七水合硫酸镁0. 02645g，甘油10ml，加水定容至IOOml制得。
6.根据权利要求4所述的一种荧光假单胞菌DA4菌株在亚麻脱胶中的应用，其特征 在于将步骤(3)所得发酵菌液于4°C，8000r/min离心，取上清液即为所得酶液，然后经 DNS比色法测定，酶液中果胶酶酶活力为205. 44U/mL，木聚糖酶酶活力为259. 57U/ml，其在 pH6. 5-9. 0，50°C以下酶活较稳定。
7.一种荧光假单胞菌DA4菌株在亚麻纱线前处理中的应用，包括步骤⑴ ⑶与权利要求4相同；(4)将灭菌后的亚麻纱线与步骤3所得发酵菌液按浴比1 20混合，在40°C，200rpm 摇床中分别脱胶1 4天，脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min，用自来水冲洗 数次以去除亚麻上的细菌，停止脱胶。
8.根据权利要求7所述的一种荧光假单胞菌DA4菌株在亚麻纱线前处理中的应用，其 特征在于所述的亚麻纱线为亚麻粗纱或亚麻二粗。
9.一种荧光假单胞菌DA4菌株在亚麻织物煮练中的应用，包括 步骤⑴ ⑶与权利要求4相同；(4)将灭菌后的亚麻织物与步骤3所得发酵菌液按浴比1 20混合，在40°C，200rpm 摇床中分别脱胶1 4天，脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min，用自来水冲洗 数次以去除亚麻上的细菌，停止脱胶。
全文摘要
本发明涉及一种荧光假单胞菌DA4菌株及其获得方法和应用，该菌株具有产果胶酶和半纤维素酶能力，具有亚麻脱胶活性。本发明所筛选的荧光假单胞菌菌种繁殖速度快，抗污染能力强，耐热性和耐碱性能好；采用该复合脱胶酶液进行亚麻脱胶不仅大大缩短了脱胶周期，体系及培养过程操作安全，无毒性、无环境污染；采用其进行亚麻微生物脱胶可缩短亚麻脱胶周期、提高亚麻纤维的出麻率、提高亚麻纤维的强度、改善亚麻纤维质量，利于推广；除可以用于亚麻原茎脱胶、粗纱煮练、亚麻织物生物前处理外，还可用于苎麻、黄麻、大麻等麻类韧皮纤维脱胶和生物前处理。
文档编号C12N1/20GK102002468SQ20101025320
公开日2011年4月6日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者丁若垚, 张兴群, 董政娥, 郁崇文 申请人:东华大学