专利名称：一种假单胞菌da10菌株及其获得方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于假单胞菌菌株及其应用领域，特别涉及一种假单胞菌DAlO菌株及其 获得方法和应用。
背景技术：
亚麻纤维天然古朴、色彩柔和，具有独特的凉爽舒适性，是化学纤维所不具 备，其它天然纤维不可比拟的，被誉为“植物纤维中的皇后”。亚麻产品具有手感滑 爽、纹理自然、色调柔和、结实耐用等风格，并且具有杀毒抗菌、防紫外线、低静电、 低磁场效应等天然功能，在风格与功能上独树一帜，具有“绿色保健”的特点，因此倍 受消费者青睐，是国际市场上最受欢迎的纺织商品之一。目前，生产上普遍采用传统的亚麻温水怄麻、雨露怄麻及天然水怄麻等方法， 均利用天然微生物及其酶对亚麻的果胶、半纤维素和木质素等胶质进行降解，菌株混 杂，难以进行有效的控制，导致脱胶时间长(温水怄麻约为4d;雨露怄麻为15-20d;天 然水怄麻5-7d)、综合长麻率低、质量不稳定(束纤维强力低)和环境污染重等诸多问 题，严重制约着亚麻产业的大力发展。尽管20世纪以来，微生物学得到了迅速发展，麻 类作物中微生物工程技术的研究也取得了较大的进展。虽然将微生物及其产生的酶类应 用于亚麻脱胶不仅可以提高纤维的产量和品质，耗能少、使用安全，可减轻对环境的污 染，具有良好的前景，但是其产业化一直未能实现。因此，筛选、分离亚麻脱胶优势菌 群并将其应用于亚麻脱胶以实现亚麻微生物快速脱胶非常重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种假单胞菌DAlO菌株及其获得方法和应 用，本发明提供菌株及培养系统能够直接用于亚麻脱胶，具有脱胶周期短，纤维分散率 达100%，脱胶效率达95%;与现有技术相比，本发明具有工艺简单、适合大规模工业化 生产等特点，对于探索假单胞菌菌株在碱性条件下进行亚麻脱胶具有潜在的理论和实践意义。本发明的一种假单胞菌DAlO菌株(CGMCC No.3851)，其特征在于该菌株具 有产果胶酶和半纤维素酶能力，具有亚麻脱胶活性。本发明的一种假单胞菌DAlO菌株的获得方法，包括(1)从东海舟山海域取样腐烂海草，先将海草与富集培养基按Ig 20ml的比例 于富集培养基中室温静置培养30天，然后取0.1ml富集培养基涂布于分离培养基，37°C 静置培养1 4天，获得自野生型脱胶优势菌株；其中，富集培养基配方为亚麻粉5g，无菌水200ml，pH自然；分离培养基配 方为亚麻粉 5g，(NH4)2SO4 5g, K2HPO4Ig, MgSO4 0.5g，KCl 0.5g, FeSO4 0.01，琼 月旨20g，水lOOOmL，用NaOH将pH调节到9 ；(2)将步骤(1)中得到的菌株接种到果胶营养培养基中，28°C培养72h，带菌落形成后，加入0.2%刚果红水溶液染色4h，倒去表面剩余刚果红溶液，加入少量蒸馏水荡 去薄层表面刚果红，对光即可见明显的绛红色水解圈，在菌落周围出现绛红色水解圈者 即为果胶分解菌(测量果胶琼脂平板上菌周围的透明圈直径和菌落直径，水解圈与菌落 直径之比大者一般有较高果胶酶活力)；然后将果胶分解菌接种到半纤维素营养培养基中，28°C培养72h，即可见水解圈 (测量水解圈和菌苔大小，并计算二者大小之比，水解圈与菌落直径之比大者一般有较高 半纤维素酶活力)；(3)通过透明圈法从上述培养基中选择出具有产果胶酶和半纤维素酶能力的菌 株。所述步骤(2)中的果胶营养培养基，其组分包括果胶2gNAN033gK2HP040.5gMgS041g琼脂20g水1000mLpH自然，7.0-7.2半纤维素营养培养基，其组分包括半纤维素(自制)20gNH4N032gK2HP042gMgS040.2g酵母膏5g琼脂20g水IOOOmLpH7.2。本发明的一种假单胞菌DAlO菌株在亚麻脱胶中的应用，包括(1)假单胞菌DAlO保存于牛肉膏蛋白胨培养基，37°C 200rpm培养24h，添加冻存缓冲液；(2)在灭菌冷却后的50mL营养肉汤培养基中，接入上述斜面培养24h的菌一 环，在转速200r/min、温度40°C条件下摇瓶培养24h ；(3)将50ml摇瓶培养后培养基接种入亚麻发酵培养基5L，在转速200r/min、 温度40°C条件下摇瓶培养24h得到发酵菌液；其中，亚麻发酵培养基配方为亚麻原麻 5g，KC10.05g,磷酸氢二钾 O.lg，MgSO4 0.05g, FeSO4 O.OOlg, (NH4)2SO4 0.5g,补水至 100ml定容(5L发酵培养基等同增加各组分用量)；将发酵菌液于4°C，SOOOr/min离心，取上清液即为所得酶液，然后经DNS比 色法测定，酶液中果胶酶酶活力为240.62U/mL，木聚糖酶酶活力为300.58U/ml，其在 pH6.5-9.0, 50°C以下酶活较稳定；(4)将灭菌后的亚麻原茎与步骤3所得发酵菌液按浴比1 20混合，在40°C， 200rpm摇床中分别脱胶1 4天，脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min，用自来水冲洗数次以去除亚麻上的细菌，停止脱胶。所述步骤(1)中的冻存缓冲液由磷酸二氢钾0.0627g，磷酸氢二钾0.0177g，柠檬 酸钠0.0588g，七水合硫酸镁0.02645g，甘油10ml，加水定容至IOOml制得。本发明的一种假单胞菌DAlO菌株在亚麻纱线前处理中的应用，包括步骤(1) (3)与权利要求4相同；(4)将灭菌后的亚麻纱线与步骤3所得发酵菌液按浴比1 20混合，在40°C， 200rpm摇床中分别脱胶1 4天，脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min， 用自来水冲洗数次以去除亚麻上的细菌，停止脱胶；其中，亚麻纱线为亚麻粗纱或亚麻二粗。本发明的一种假单胞菌DAlO菌株在亚麻织物煮练中的应用，包括步骤(1) (3)与权利要求4相同；(4)将灭菌后的亚麻织物与步骤3所得发酵菌液按浴比1 20混合，在40°C， 200rpm摇床中分别脱胶1 4天，脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min， 用自来水冲洗数次以去除亚麻上的细菌，停止脱胶。该菌株除可以用于黄麻、大麻等韧皮纤维脱胶及其织物前处理外等。根据16sR DNA测序Blast及聚类分析结果，该菌与假单胞菌Pseudomonas sp相 似性为99%，结合生理生化试验结果和镜检分析，命名此菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp)DA10 菌株。本发明所提供的具有亚麻脱胶活性的假单胞菌已于2010年5月17日保藏在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，保藏号为CGMCCNo.3851。本发明提供的假单胞菌菌株Pseudomonas sp DAlO特征如下(附
图1、图2)
权利要求
1.一种假单胞菌DAlO菌株(CGMCC No.3851)，其特征在于该菌株具有产果胶酶 和半纤维素酶能力，具有亚麻脱胶活性；其16SrRNA序列，如下GGGCGCGCAGTGATTCGAGCTCGGTACCGTAATACGACTCACTATAGGGCGACAT ATGATCGATGATATCCCATGGGCGGCCGCCTGCAGACCAGGTCTGGTTACCTTGTTAC GACTTCACCCCAGTCATCGGCCACACCGTGGCAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCCA CCTGCTTCTGGTGCAACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGG GAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGA GTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGGACTGAGATAGGGTTTCTGGGATTGGCTTACCGTC GCCGGCTTGCAGCCCTCTGTCCCTACCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCTGGCCGTAAG GGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCGGTCTCCT TAGAGTTCCCACCATTACGTGCTGGCAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGG ACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTCG AGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCGACATGTCAAGGCCAGGTA AGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCG TCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGCGAACTTAACGCG TTAGCTTCGATACTGCGTGCCAAATTGCACCCAACATCCAGTTCGCATCGTTTAGGGC GTGGACTACCAGGGTATCTAACCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCCTCAGTGTCA GTGTTGGTCCAGGTAGCTGCCTTCGCCATGGATGTTCCTCCTGATCTCTACGCATTTCA CTGCTACACCAGGAATTCCGCTACCCTCTACCACACTCTAGTCGCCCAGTATCCACTGC AGTTCCCAGGTTGAGCCCAGGGCTTTCACAACGGACTTAAACGACCACCTACGCACG CTTTACGCCCAGTAATTCCGAGTAACGCTTGCACCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGG CACGAAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTTGGGTACCGTCATCCCAACCGGGTATTAGCCA GCTGGATTTCTTTCCCAACAAAAGGGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACCCACGC GGTATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGT AGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTAC GGATCGTCGCCTTGGTGGGCCTTTACCCCGCCAACTAGCTAATCCGACATCGGCTCAT TCAATCGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCACCCGTAGGTCGTATGCGGTATTA GCGTAAGTTTCCCTACGTTATCCCCCACGAAAAAGTAGATTCCGATGTATTCCTCACCC GTCCGCCACTCGCCACCCAGAGAGCAAGCTCTCCTGTGCTGCCGTTCGACTTGCATG TGTTAGGCCTACCGCCAGCGTTCACTCTGAGCCAGGATCAAACTCT。
2.一种假单胞菌DAlO菌株的获得方法，包括(1)从东海舟山海域取样腐烂海草，先将海草与富集培养基按Ig 20ml的比例于富 集培养基中室温静置培养30天，然后取0.1ml富集培养基涂布于分离培养基，37°C静置 培养1 4天，获得自野生型脱胶优势菌株；其中，富集培养基配方为亚麻粉5g，无菌水200ml，pH自然；分离培养基配方 为亚麻粉 5g，(NH4)2SO4 5g, K2HPO4Ig, MgSO4 0.5g，KCl 0.5g, FeSO4 0.01，琼脂 20g，水 1 OOOmL，用 NaOH 将 pH 调节到 9 ；(2)将步骤(1)中得到的菌株接种到果胶营养培养基中，28°C培养72h，带菌落形成 后，加入0.2%刚果红水溶液染色4h，倒去表面剩余刚果红溶液，加入少量蒸馏水荡去薄层表面刚果红，对光即可见明显的绛红色水解圈，在菌落周围出现绛红色水解圈者即为 果胶分解菌；然后将果胶分解菌接种到半纤维素营养培养基中，28°C培养72h，即可见 水解圈；(3)通过透明圈法从上述培养基中选择出具有产果胶酶和半纤维素酶能力的菌株。
3.根据权利要求2所述的一种假单胞菌DAlO菌株的获得方法，其特征在于所述步 骤(2)中的果胶营养培养基，其组分包括果胶2gNAN033gK2HP040.5gMgS04Ig琼脂20g水IOOOmLpH自然，7.0-7.2半纤维素营养培养基，其组分包括 半纤维素(自制)20g NH4N032gK2HP042gMgS040.2g酵母膏5g琼脂20g水IOOOmLpH7.2。
4.一种假单胞菌DAlO菌株在亚麻脱胶中的应用，包括(1)假单胞菌DAlO菌株保存于牛肉膏蛋白胨培养基，37°C200rpm培养24h，添加冻 存缓冲液；(2)在灭菌冷却后的50mL营养肉汤培养基中，接入上述斜面培养24h的菌一环，在 转速200r/min、温度40°C条件下摇瓶培养24h ；(3)将50ml摇瓶培养后培养基接种入亚麻发酵培养基5L，在转速200r/min、温度 40°C条件下摇瓶培养24h得到发酵菌液；其中，亚麻发酵培养基配方为亚麻原麻5g， KC10.05g,磷酸氢二钾 O.lg，MgSO4 0.05g, FeSO4 O.OOlg, (NH4)2SO4 0.5g,补水至 100ml定容；(4)将灭菌后的亚麻原茎与步骤3所得发酵菌液按浴比1 20混合，在40°C，200rpm 摇床中分别脱胶1 4天，脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min，用自来 水冲洗数次以去除亚麻上的细菌，停止脱胶。
5.根据权利要求4所述的一种假单胞菌DAlO菌株在亚麻脱胶中的应用，其特征在 于所述步骤(1)中的冻存缓冲液由磷酸二氢钾0.0627g，磷酸氢二钾0.0177g，柠檬酸钠 0.0588g，七水合硫酸镁0.02645g，甘油10ml，加水定容至IOOml制得。
6.根据权利要求4所述的一种假单胞菌DAlO菌株在亚麻脱胶中的应用，其特征在 于将步骤(3)所得发酵菌液于4°C，SOOOr/min离心，取上清液即为所得酶液，然后经DNS比色法测定，酶液中果胶酶酶活力为240.62U/mL，木聚糖酶酶活力为300.58U/ ml,其在pH6.5-9.0，50°C以下酶活较稳定。
7.一种假单胞菌DAlO菌株在亚麻纱线前处理中的应用，包括步骤⑴ ⑶与权利要求4相同；(4)将灭菌后的亚麻纱线与步骤3所得发酵菌液按浴比1 20混合，在40°C，200rpm 摇床中分别脱胶1 4天，脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min，用自来 水冲洗数次以去除亚麻上的细菌，停止脱胶。
8.根据权利要求7所述的一种假单胞菌DAlO菌株在亚麻纱线前处理中的应用，其特 征在于所述的亚麻纱线为亚麻粗纱或亚麻二粗。
9.一种假单胞菌DAlO菌株在亚麻织物煮练中的应用，包括步骤⑴ ⑶与权利要求4相同；(4)将灭菌后的亚麻织物与步骤3所得发酵菌液按浴比1 20混合，在40°C，200rpm 摇床中分别脱胶1 4天，脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min，用自来 水冲洗数次以去除亚麻上的细菌，停止脱胶。
全文摘要
本发明涉及一种假单胞菌DA10菌株及其获得方法和应用，该菌株具有产果胶酶和半纤维素酶能力，具有亚麻脱胶活性。本发明提供菌株及培养系统能够直接用于亚麻脱胶，具有脱胶周期短，纤维分散率达100％，脱胶效率达95％，菌种不易被污染，处理成本低，纤维质量好，脱胶条件温和，抗污染能力强，耐热性能好，无环境污染等优点；与现有技术相比，本发明具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点，对于探索假单胞菌菌株在碱性条件下进行亚麻脱胶具有潜在的理论和实践意义。
文档编号C12S11/00GK102010837SQ20101025318
公开日2011年4月13日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者丁若垚, 张兴群, 董政娥, 郁崇文 申请人:东华大学