用于生物控制假单胞菌的方法
【专利摘要】本发明涉及用于控制假单胞菌的增殖的方法，其中向人体或动物体施加的处理方法除外，其特征在于其使用Willaertia magna种的原生动物，并且还涉及包含这种原生动物的消毒剂。
PTA-7824
2006.08.21
PTA-7825
2006.08.21
【专利说明】用于生物控制假单胞菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于生物控制假单胞菌（Pseudomonas)的存在及其增殖的新方法。
【背景技术】
[0002] 假单胞菌是属于假单胞菌科的革兰氏阴性细菌。在人中，这种细菌是形成各种皮 肤、内脏和肺部感染，特别是囊性纤维化的原因（4, 19)。这些细菌能够抵抗众多防腐剂和抗 生素（2) (7)，这无疑部分解释了它们在医院的日益频繁的存在，在那里它们可以从潮湿的 环境（水槽、U型弯、花瓶、毛巾和洗涤物、含水容器等）分离到。一些种（species)也具有 对于植物（8)、线虫（10)和变形虫（1，11，16)的致病能力。因此，这种细菌的监测和控制构 成了日益重要的当务之急。
[0003] 通常，已知在环境中，假单胞菌具有普遍分布（5)，因为这种细菌已经从土壤、从污 水或从工业废水和生物膜分离到，其特征在于它与自由生活的变形虫共享。几种潜在的致 病细菌（嗜肺军团菌（Legionella pneumophila)、分枝杆菌属（Mycobacterium spp)和大 肠杆菌0157:H7)已经发展了在自由生活的变形虫内部存活和复制的机制（15)。此外，已 经表明，细菌，包括假单胞菌，可以发展各种策略，允许它们逃避自由生活的变形虫的捕食 (12, 13, 18)。具体而言，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)形成生物膜是允许细菌 有效逃避自由生活的变形虫诸如多食棘变形虫（Acanthamoeba polyphaga)的捕食的机制 之一（18)。尽管已知某些自由生活的变形虫诸如棘变形虫（Acanthamoeba)能够发展针对 假单胞菌的趋化响应且能够以这些细菌为食（17, 18)，但也表明，铜绿假单胞菌快速抑制 这些变形虫的生长并通过分泌毒素诱导它们的胞囊形成和它们的死亡（11-13, 17, 18)。也 已经在纤毛原生动物上证实了假单胞菌的毒性作用（9)。
[0004] 因此，其清楚地显示，自由生活的原生动物和变形虫构成假单胞菌的生态学的重 要因素。此外，假单胞菌感染原生动物和在原生动物中细胞内存活的能力强烈表明，这些原 生动物是促进假单胞菌耐受目前使用的杀生物处理的因素，如Michel等人所指出（14)。
【发明内容】
[0005] 在这种背景下，本发明人已经表明，完全出乎意料的是，该变形虫属Willaertia magna根除假单胞菌细菌。将这种杀生物效果添加至已经证实的Willaertia magna对其它 变形虫试剂的捕食的能力，这可以充当假单胞菌的载体（3)。
[0006] 因此，本发明的一个主题首先是用于控制假单胞菌的增殖的方法，其使用 Wi 11 aert ia magna属的原生动物。根据本发明的方法不包括向人体或动物体施加的处理方 法。在根据本发明的方法中，其最通常是用Willaertia属，特别是Willaertia magna种的 原生动物处理的气体或液体流。
[0007] 根据本发明的方法可以特别用在卫生用水或工业用水分配网络、用于工业厂房的 冷却回路或空调网络的消毒中。可以将原生动物直接添加至待处理的管或网络中循环的水 或液体。也可以将它们例如作为气溶胶的水溶液形式喷雾在待消毒的工业网络、烟囱和工 厂中，和待消毒的工业表面上。
[0008] 有利地，在本发明的上下文中使用的原生动物对应于在2006年8月21日以 编号PTA 7824保藏于ATCC的菌株，或者在2006年8月21日以编号PTA 7825保藏于 ATCC 的菌株，这两种菌株以 Centre National de la Recherche Scientifique(CNRS) [French National Center for Scientific Research]-3rue Michel Ange-75794 Paris Cedex 16/France-和 Uinversite Lyon lClaude Bernard[Lyon lClaude Bernard University]_43Boulevard du llNovembre 1918_69622Villeurbanne Cedex/France 的名 义保藏。
[0009] 对应于以编号PTA7824保藏于ATCC的菌株或以编号PTA7825保藏于ATCC的菌 株的属于Willaertia属的原生动物是本发明的组成部分。所述保藏的菌株PTA7824和 PTA7825还描述于PCT国际申请W02008/043969的公布说明书中。
[0010] 因此这种原生动物可以用于消毒剂中，特别是用于消除假单孢菌细菌和用于控制 假单胞菌的增殖和污染。
[0011] 此外，本发明的一个主题是含有Willaertia属、特别是Willaertia magna种的 原生动物的消毒剂。对应于以编号PTA7824保藏于ATCC的菌株或以编号PTA7825保藏于 ATCC的菌株的原生动物将是优选的。有利地，根据本发明的消毒剂是例如在蒸馏水中的水 溶液或悬浮液的形式。消毒剂可以是可喷雾的形式，例如作为气溶胶或任何其它施用方式。
[0012] 本发明人已经通过将用作变形虫模型的棘变形虫（Acanthamoeba)属和哈氏虫 (Hartmannella)属中假单胞菌的复制与Willaertia变形虫属中观察到的复制进行比较 而证实了 Willaertia属、特别是Willaertia magna种的原生动物的假单胞菌增殖抑制 活性。还通过证实Willaertia magna对铜绿假单胞菌形成的生物膜的捕食作用而证实 Willaertia属、特别是Willaertia magna种的原生动物的活性。
[0013] 本发明的一个主题还是消毒剂或如上所述的原生动物作为对假单胞菌的杀生物 剂的用途。
[0014] 考虑到变形虫在外部环境中假单胞菌的增殖和维持中发挥的至关重要的作用，根 据本发明的方法和消毒剂在成本、有效性和特别是环境友好的方面具有众多优点。
[0015] 下文实施例可以说明本发明，但不具有限性质。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1显示在以10的初始变形虫/细菌比率置于与假单胞菌的共培养后，蠕形 哈氏虫（Hartmannella vermiformis)( "方形"符号)、卡氏棘变形虫（Acanthamoeba castellanii)( "菱形"符号?)和 Willaertia(Willaertia magna- "三角"符号▲)变形 虫的各群体的自发进化。
[0017] 如材料和方法部分中所述，以10的比率（10个细菌/1个变形虫）将各种自由生 活的变形虫置于与假单胞菌的共培养中（时间〇小时=T0)。每3小时采集共培养悬浮液 的等分试样：即T0，T0+3h，T0+6h。活变形虫的百分比通过台盼蓝排斥试验和使用Malassez 细胞的显微镜观察来测定。该数据表示为在台盼蓝排斥试验中阴性的活细胞的％。
[0018] 图2显示与棘变形虫和哈氏虫但不与Willaertia共培养的假单胞菌的生长。
[0019] 将变形虫（5X104个）悬浮在水中并接种至孔中。1小时后，将假单胞菌添加至孔 中，以便实现如小图A中所示的各种MOI。将共培养物在30°C孵育并在24小时和48小时 后检查。A.注意在含有Willaertia与假单胞菌的孔中不存在细菌增殖。B.将含有100个 细菌/1个变形虫和10个细菌/1个变形虫（分别为M01100和M0110)的孔的100 yl上清 液连续稀释（用无菌去离子水的稀释度范围为1〇_6至1〇_8)，并接种到TSA琼脂上。注意， 在与Willaertia magna(W)共培养的上清液中不存在细菌菌落的生长，以及，相反地，在哈 氏虫（H)存在的情况下假单胞菌的强烈生长。
[0020] 图3显示在与各种变形虫属包括Willaertia属（Willaertia magna- "交叉"符 号X)共培养获得的假单胞菌（"菱形"符号?)的生长的比较动力学
[0021] 以10的比率（10个细菌/1个变形虫）将各种自由生活的变形虫分别置于与假 单胞菌的共培养中（时间0小时=T0)。每3小时采集共培养悬浮液的等分试样：即T0， T0+3h，T0+6h，并且如材料和方法部分中所述测定假单胞菌浓度。仅包含浓度等于共培养的 浓度的假单胞菌细菌的阳性对照将充当培养基中假单胞菌的生长的对照。注意与卡氏棘 变形虫（"方形"符号)和蠕形哈氏虫（"三角"符号▲)的共培养中的细菌增殖。
[0022] 图4显示Willaertia magna对假单胞菌形成的生物膜的杀生物作用。
[0023] 将假单胞菌和Willaertia magna接种至TSA琼脂上，并在30°C孵育24小时。A.如 图4A中的箭头所示，假单胞菌生物膜裂解斑块在Willaertia magna的沉积物上形成并超 出沉积物形成。B.由箭头所示的生物膜裂解斑块之前。注意，在右边，在细菌膜不存在的情 况下Willaertia magna沉积物的部位。注意，在左边，假单胞菌的层。
【具体实施方式】
[0024] 1.材料和方法
[0025] 1. 1. #用的菌株:
[0026] 假单胞菌：使用的菌株是CL5210菌株（Oxoid，France)。
[0027] -将其以每周一次亚培养的速度维持在TSA(胰蛋白胨大豆琼脂）（批号 P05012,0xoid，France)上。将该菌株以宽条纹接种到TSA板上，并在30°C下孵育2天。
[0028] _变形虫：使用的菌株属于三种不同的变形虫种：
[0029] 〇 蠕形哈氏虫，
[0030] 〇 卡氏棘变形虫（ATCC30010)
[0031] 〇 Willaertia magna(以编号 PTA7824 和 PTA7825 保藏于 ATCC 的菌株）
[0032] 将这三种菌株在SCGYEM培养基（血清酪蛋白葡萄糖酵母提取物培养基）上在存 在10%胎牛血清的情况下无菌培养，以3ml/每管的比例分布在Falcon?管（3033)中。在 维持中，将繁殖形式每8-9天亚培养。对于共培养，使用3至4天亚培养，以便正好在指数 生长期中具有活动体。
[0033] 如下获得SCGYEM培养基：
[0034] > 酪蛋白（Merck 1.02244.010) 10 g Na2HP04 1.325 g KH2P〇4 0.8 g 葡萄糖 2.5 g 酵母提取物(Difco 0127-17-9) 5 g 蒸馏水 900 ml 胎牛血清 100 ml
[0035] 将2. 5ml NaOH(IN)，然后Na2HP04和KH2P04添加至900ml蒸馏水中。将混合物在 热板上略加热，然后在磁力搅拌的情况下逐渐添加酪蛋白。酪蛋白溶解后，加入葡萄糖和酵 母提取物。
[0036] 完全溶解后，将混合物依次在玻璃纤维（Sartorius SM6513400)，然后在1 y m膜 (Whatman7190004)上过滤。然后将培养基等分分装到玻璃瓶中。将瓶子在120°C下在高压 灭菌器中灭菌20分钟。在培养基的最终用途和分配之前，在层流罩中以最终体积10%的比 例无菌添加胎牛血清。
[0037] 1. 2.假单朐菌的单夺形虫共培养
[0038] 1. 2. 1.细菌接种物的制各：
[0039] 从TSA上的2天培养物制备无菌蒸馏水中假单胞菌的悬浮液，从而获得在550nm 处个1光密度单位，即l〇9CFU(集落形成单位）/ml的浓度。
[0040] 1. 2. 2.讲行单夺形虫共培养
[0041] 在含有3ml高压灭菌水的细胞培养管（Falcon K_ 3033)中进行共培养。从在 Malassez血细胞计数器上事先计数的无菌变形虫悬浮液以IX 105个变形虫/ml的比例进 行管的接种。用假单胞菌侵染变形虫通过固定10的假单胞菌/变形虫比率，即1 X 106个 细菌/ml接种培养基而进行。侵染后，立即将共培养管以低速离心（760g持续lOmin)，以促 进变形虫和细菌之间的接触。l〇min后，将管手动重悬，并在30°C下在培养箱中以倾斜位置 孵育。
[0042] 置于共培养中的变形虫和假单胞菌的命运通过以下方式确定：
[0043] 共培养在细菌侵染后监测6个小时。在每个时间间隔（每3小时），将共培养管 取样，并在涡旋器上剧烈搅拌以便从壁分离变形虫后从变形虫观点和细菌观点两者进行检 查。对于每个检查的管：
[0044] _变形虫直接在Malassez细胞上计数。
[0045] _假单胞菌浓度通过在Eppendorf微管中在无菌蒸馈水中10倍连续稀释后直接在 TSA上将培养基铺出来测定。每个稀释度以100 ill/每板的比例一式三份在TSA上铺出。 然后将板在30°C下孵育最少48小时。TSA的第一个读数在铺出后24小时通过计数集落而 进行；随后在第2天第二次读数以确认。假单胞菌浓度以CFU/ml孵育培养基表示，其考虑 稀释因子，并假设各集落对应于稀释的悬浮液中初始存在的一个细菌。
[0046] 对于每种变形虫属，将假单胞菌生长曲线表示为时间的函数。
[0047] 此外，假单胞菌对各种变形虫种可能的细胞毒性作用以如下方式测定：
[0048] ?通过计数在台盼蓝排斥试验中阳性的变形虫的比例。该试验在显微镜下通过计 数Malassez细胞中台盼蓝阳性细胞的数目/总细胞的数目而进行。
[0049] 1. 3. Willaertia magna对假单胞菌牛.物膜的影口向
[0050] 将Willaertia沉积在刚刚在TSA上铺出的假单胞菌层上。将琼脂在30°C下放 置24小时，以便使细菌膜在琼脂表面上生长。然后在光学显微镜（放大倍数X400)下观 察琼脂，以检测其内可能的细菌层裂解斑块的形成。
[0051] 2?结果
[0052] 2. L Willaertia magna表现耐受假单胞菌
[0053] 假单胞菌对测试的各种变形虫种存活的影响通过台盼蓝排斥试验来测定。非常快 速地，将卡氏棘变形虫置于与细菌的共培养中后，主要的细胞毒性作用发生在这种变形虫 种中，其中共培养3小时后存活力下降?30% (参见图1)。相反，当将Willaertia magna 置于与假单胞菌的共培养中（包括以维持接近100%存活力孵育长达9小时）时，从未观察 到这种现象（图1)。像Willaertia magna，自由生活的懦形哈氏变形虫在通过台盼蓝排斥 测定的存活力方面没有表现出任何下降（图1)。所有这些观察（无胞囊形成和无假单胞菌 诱导的细胞毒性）清楚地表明，Willaertia magna和蠕形哈氏虫，与卡氏棘变形虫类型的 其它变形虫种相反，表现出抵抗假单胞菌的初始能力。
[0054] 2. 2Willaertia magna 捕食假单胞菌
[0055] 在存在属于哈氏虫属和棘变形虫属的变形虫的情况下进行的假单胞菌共培养的 结果表明在存在这两种变形虫属的情况下的相当的增殖，因为在6小时内注意到细菌浓度 的增加（见图2)。相反（尽管共培养在严格相同的条件下进行），与仅含有假单胞菌的对 照相比，在存在Willaertia magna变形虫的情况下注意到可检测的假单胞菌浓度降低约1 个对数（参见图2和图3)。所测量的假单胞菌浓度下降表明Willaertia magna针对假单 胞菌的大量捕食作用。
[0056] Willaertia magna和懦形哈氏虫存活，但只有Willaertia magna防止细菌增殖。 Willaertia magna对假单胞菌的这种作用在图3和图4中进一步说明。在水中孵育48小 时后，棘变形虫和哈氏虫与细菌的共培养表明假单胞菌的增殖（注意由于细菌的增殖导 致的含有假单胞菌和哈氏虫或棘变形虫的孔的浑浊外观）（图3,小图A)。当假单胞菌以10 的M0I (10个细菌/1个变形虫）孵育时，在共培养孔的上清液中测定的所述细菌浓度表明 不存在细菌与Willaertia magna(图3,小图B)。
[0057] 图4还表明Willaertia magna对假单胞菌的捕食作用。事实上，在存在 Willaertia magna的情况下24小时后，其中细菌层已经消失的琼脂表面显得非常清楚 (这些区域在此被称为细菌层/生物膜裂解斑块-图4,小图A)。琼脂的显微镜检查也显 示，Willaertia magna集中在这个裂解斑块的限度；这种效应也显示在图4,小图B，其中在 Willaertia magna作用下的细菌层的消失是清楚明显的。所有这些数据和观察结果清楚地 表明Willaertia magna针对已经形成生物膜的致病细菌假单胞菌的捕食作用。
[0058] 参考文献
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【权利要求】
1. 用于控制假单胞菌的增殖的方法，其中向人体或动物体施加的处理方法除外，其特 征在于其使用Willaertia属的原生动物。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于气体或液体流或固体表面用Willaertia属， 特别是Willaertia magna种的原生动物处理。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于这些原生动物有利地对应于以编号 PTA7824保藏于ATCC的菌株或以编号PTA7825保藏于ATCC的菌株。
4. 如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于其实施用于卫生用水或工业用水 分配网络、用于工业厂房的冷却回路或空调网络的消毒中。
5. 如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于其实施用于控制水管，或可能与 人或动物食品接触的表面中生物膜的形成。
6. 含有Willaertia属、特别是Willaertia magna种的原生动物的消毒剂作为对假单 胞菌的杀生物剂的用途，其中向人体或动物体施加的处理用途除外。
7. 如权利要求6所述的用途，其特征在于所述原生动物对应于以编号PTA7824保藏于 ATCC的菌株或以编号PTA7825保藏于ATCC的菌株。
8. 如权利要求6或7所述的用途，其特征在于所述消毒剂为水溶液或悬浮液的形式。
【文档编号】A01N63/00GK104302182SQ201280062183
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2012年12月20日 优先权日:2011年12月20日
【发明者】F·普拉松, S·博德纳克 申请人:阿莫巴