专利名称：一株铜绿假单胞菌及其获取方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程，特别涉及一株可高效分解石油类物质的铜绿假单胞菌及其获取方法与应用。技术背景
随着世界对石油及其制品需求的日益增长，在石油的开采、运输、装卸及利用过程中的溢油事故也日渐增多。溢油不仅造成了严重的环境污染，并且由于石油中烃类污染物的潜在毒性和生物累积效应会导致环境质量和生物种类多样性的严重下降，破坏生态系统的功能，造成恶性的环境破坏与巨大的经济损失。此外，石油中的多环芳烃类化合物具有强烈的致畸、致癌和致突变效应，可通过食物链进入生物体与人体，具有生物累积效应，对生物和人的健康造成潜在的危害。因此，研究石油污染的控制与修复问题可保持生态系统的良性循环，保障人民的身体健康，促进经济和社会的可持续发展。
目前，石油污染土壤的修复方法主要包括物理法、化学法及生物法。比较而言，生物法具有物理法和化学法不可比拟的优势。首先是生物法的处理费用低，其处理成本大约只有物化方法的三分之一；其次是生物法的修复操作简单，可实现原位直接修复；再次，生物法修复对环境的二次污染小。生物修复法包括动物修复、植物修复及微生物修复；这三种方法中由于微生物资源丰富、易于培养、对环境的耐受性较强，因此，微生物修复被认为具有广阔的应用前景。
微生物修复技术的关键是从环境中筛选出可高效降解石油污染物的微生物，效率高且周期短。在被石油长期污染的环境中，存在大量的石油降解菌，可从中筛选出高效的石油降解菌株。发明内容
本发明的目的，是提供一株铜绿假单胞菌及其获取方法与应用，该铜绿假单胞菌株可稳定高效地分解多种石油类物质，可有效地用于环境中石油污染物的生物降解与环境修复。
本发明所提供的铜绿假单胞菌SJTD-I来源于大庆油田的石油长期污染土壤中， 经过人工富集、筛分及纯化所得。SJTD-I菌落呈圆形，隆起，菌落呈黄绿色，透明，边缘无规则扩散，产生荧光色素，革兰氏染色呈阴性，直或弯的杆菌，单个，无芽孢，好氧，30°C下生长良好，有恶臭气味。经对该菌株的16S rDNA的鉴定与序列分析，表明该菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。该铜绿假单胞菌SJTD-1菌株已于2012年9月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号) 保藏，登记入册编号为CGMCCNo. 6584。
为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案
一株铜绿假单胞菌，命名为SJTD-I，其保藏编号为CGMCC No. 6584。
上述铜绿假单胞菌的16S rDNA片段的序列如SEQ ID NO. I所示。
上述铜绿假单胞菌的获取方法，包括以下步骤
A、采集被石油长期污染土壤作为微生物源；
B、以石油为单一碳源,制备含有500mg/L石油的IOOmL BSM无机培养基,用盐酸调 pH 值至 7. 0-7. 2，121°C 灭菌 20min ；
C、待培养基温度降低到30°C左右时，按照3%的土壤接种量在超净台下接种；
D、30°C、180rpm的恒温摇床培养箱中进行富集培养；
E、重复培养七次后，在固体培养基平板上反复划线培养，直至分离出单菌株，之后再将菌株接种入上述无机培养基内驯化，上述操作重复多次，得到纯化的铜绿假单胞菌菌株，命名为SJTD-I。
上述铜绿假单胞菌的获取方法，其中，所述BSM无机培养基的无机成分及浓度如下Κ2ΗΡ04，0· 5g/L ;ΚΗ2Ρ04，3· 815g/L ； (NH4) 2HP04,0. 825g/L ；MgCl2 · 6H20，20mg/L ；FeCl3, 0. 2mg/L ；CaCl2, 2mg/L ；Na2S04, 200mg/L ；KN03,1. 2625g/L。
上述铜绿假单胞菌的应用，用于环境中石油类物质的分解与去除。
上述铜绿假单胞菌的应用，其中，所述石油类物质包括Cltl-C3tl的烷烃和石油。
本发明的SJTD-I菌株可在浓度高达10g/L的石油及烷烃类物质为唯一碳源的培养基中正常生长，24小时内能将初始浓度为500mg/L的C16-C2q的长链烷烃和石油完全分解，36小时可将高达2g/L的C16-C2tl的长链烷烃和500mg/L原油全部分解；七天对5g/L的原油的分解率大于85%。
依据本发明，由于铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株具有高效降解石油类物质的特性，可应用于含有石油类物质的环境治理与土壤修复。本发明与现已发现的石油降解菌株相比，其降解效率显著提高，降解周期明显缩短。
图I为本发明的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株的平板划线图2为本发明的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株以不同浓度 (■ 100mg/L ；· 250mg/L ；▲ 500mg/L ；ψ lg/L ； 2g/L)的 C14 为单一碳源时菌株的生长曲线.
图3为本发明的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株以不同浓度 (■ 100mg/L ；· 250mg/L ；▲ 500mg/L ；ψ lg/L ； 2g/L)的 C16 为单一碳源时菌株的生长曲线.
图4为本发明的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株以不同浓度 (■ 100mg/L ；· 250mg/L ；▲ 500mg/L ；ψ lg/L ； 2g/L)的 C18 为单一碳源时菌株的生长曲线.
图5为本发明的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株以不同浓度 (■ 100mg/L ；· 250mg/L ；▲ 500mg/L ；ψ lg/L ； 2g/L)的 C20 为单一碳源时菌株的生长曲线.
图6为本发明的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株对不同浓度 (■ 250mg/L ；· 500mg/L ；▲ lg/L ；ψ 2g/L)的十六焼的降解曲线；页
图7为本发明的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-I菌株对5g/L原油的降解曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施不局限于此。
一、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株的获取与保藏
采集大庆油田的石油长期污染土壤作为微生物源，冷藏运回实验室。制备含有 500mg/L石油的BSM无机培养基，按照3%的土壤接种量接种于含有IOOmL上述无机培养基的500mL三角瓶中，(所述BSM无机培养基的无机成分及浓度如下=K2HPO4,0. 5g/L ; ΚΗ2Ρ04，3· 815g/L ； (NH4) 2ΗΡ04，0. 825g/L ；MgCl2 · 6H20，20mg/L ；FeCl3,0. 2mg/L ；CaCl2, 2mg/ L ;Na2S04，200mg/L ;KN03，1. 2625g/L。)盐酸调 pH 值为 7. 0_7. 2，高压灭菌锅 121 °C 灭菌 20min。待培养基温度降低到30°C左右时，在超净台下接种。污泥接种后在30°C、180rpm的恒温摇床培养箱中进行富集培养。重复培养七次后，在固体培养基平板(琼脂20. 0g/L)上反复划线培养，直至分离出单菌株。之后再将菌株接种入上 述无机培养基内驯化，上述操作重复多次，得到纯化的可降解石油类物质的SJTD-I菌株，平板划线图如图I所示。SJTD-I菌落呈圆形，隆起，菌落呈黄绿色，透明，边缘无规则扩散，产生荧光色素，革兰氏染色呈阴性， 直或弯的杆菌，单个，无芽孢，好氧，30°C下生长良好，有恶臭气味。经对该菌株的16S rDNA 的鉴定与序列分析，表明该菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。该铜绿假单胞菌SJTD-I菌株已于2012年9月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号)保藏，登记入册编号为CGMCC No. 6584。
二、铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa SJTD-1 菌株的鉴定
将分离出的SJTD-I菌株进行16S rDNA序列的扩增、序列测定与数据库比对。利用基因组提取试剂盒(TIANGEN，北京)提取SJTD-I菌株的基因组DNA，之后，利用16S rDNA 片段扩增与检测试剂盒(Takara，大连)扩增该菌株的16S rDNA片段并测定序列。SJTD-I 菌株的 16S rDNA 序列如 SEQ ID NO. I 所不。与 NCBI 数据库(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)比对,表明该SJTD-I菌株为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa,菌株为无芽孢杆菌，单个，属革兰氏阴性菌，严格好氧，化能异养。
三、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株对石油类物质(长链烧烃和石油)的降解能力
将Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株划固体培养基平板,30°C过夜培养。挑取单克隆，分别接种于以500mg/L-5g/L的长链烷烃(C14、C16、C18、Cj和石油为唯一碳源的液体培养基中，30°C，120rpm恒温振荡培养箱中培养7天。采集不同时间点的2个3ml平行样品，一个样品利用紫外分光光度仪(UV-2100spectrophotometer, Unic)测定600nm吸光度值用以表示微生物生长情况，(其中，以C14、C16, C18, C20为单一碳源时菌株的生长曲线如图2至图5所示。)另一个样品中加入1/6体积正己烷(HPLC纯)混匀，超声5min，3000g 离心5min，取上层有机相；重复两次，合并萃取液。加入无水Na2SO4混合，加内标正十五烷 (终浓度100ng/ul)后定容到3ml。采用气相色谱(GC，Agilent 6850)测定石油烃浓度，色谱柱为DB-5MS capillary柱(0. 25mmX30mX0. 25 μ m)。不同十六烧浓度测定结果见图6, 不同原油浓度测定结果见图7。SJTD-I菌株可在高达10g/L的石油及烷烃类物质为唯一碳5源的培养基中正常生长，24小时内能将初始浓度为500mg/L的C16-C2tl的长链烷烃和石油完全分解，36小时可将高达2g/L的C14、C16, C18, C20的长链烷烃和500mg/L石油全部分解；七天对5g/L的原油的分解率大于85%。
序列表
〈110〉上海交通大学
〈120〉一株铜绿假单胞菌及其获取方法与应用
〈160〉I
<170>PatentIn version
〈210〉I
〈211>1509
<212>DNA
〈213〉铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) SJTD-116S rDNA 序列
<400>1 tgggtttgatcttggttagattgacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcgg60
atgaagggagcttgctcctggattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgc120
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ggacggttaccacggagtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtagtc1500
gtgactgga1509
权利要求
1.一株铜绿假单胞菌菌株，命名为SJTD-I，其保藏编号为CGMCC No. 6584。
2.根据权利要求I所述的铜绿假单胞菌，其特征在于，所述铜绿假单胞菌的16SrDNA片段的序列如SEQ ID NO. I所示。
3.根据权利要求I所述的铜绿假单胞菌的获取方法，其特征在于，包括以下步骤 A、采集被石油长期污染的土壤作为微生物源； B、以石油为单一碳源，制备含有500mg/L石油的IOOmLBSM无机培养基，用盐酸调pH值至 7. 0-7. 2，121°C 灭菌 20min ； C、待培养基温度降低到30°C左右时，按照3%的土壤接种量在超净台下接种； D、30°C、180rpm的恒温摇床培养箱中进行富集培养； E、重复培养七次后，在固体培养基平板上反复划线培养，直至分离出单菌株，之后再将菌株接种入上述无机培养基内驯化，上述操作重复多次，得到纯化的铜绿假单胞菌菌株，命名为 SJTD-I。
4.根据权利要求3所述的铜绿假单胞菌的获取方法，其特征在于所述BSM无机培养基的无机成分及浓度如下=K2HPO4,0. 5g/L ；KH2P04, 3. 815g/L ； (NH4) 2HP04,0 . 8 2 5g/L ；MgCl2 · 6H20, 20mg/L ；FeCl3,0. 2mg/L ；CaCl2, 2mg/L ；Na2S04, 200mg/L ；KN03,1. 2625g/L。
5.根据权利要求I所述的铜绿假单胞菌的应用，用于环境中石油类物质的分解与去除。
6.根据权利要求5所述的铜绿假单胞菌的应用，其特征在于所述石油类物质包括C10-C30的烧烃和石油。
全文摘要
本发明提供了一株铜绿假单胞菌菌株，命名为SJTD-1，其保藏编号为CGMCCNo.6584。本发明中的铜绿假单胞菌能利用烷烃类物质、石油作为唯一碳源生长，在石油污染土壤的修复中具有较高的应用价值。菌株SJTD-1可在浓度高达10g/L的石油及烷烃类物质为唯一碳源的培养基中正常生长，24小时内能将初始浓度为500mg/L的C16-C20的长链烷烃或石油完全分解，36小时可将高达2g/L的C16-C20的长链烷烃或500mg/L原油全部分解；七天对5g/L的原油的分解率大于85％。本发明铜绿假单胞菌SJTD-1能够快速高效降解石油，对石油污染的土壤具有修复作用。
文档编号C12N1/20GK102925391SQ20121043666
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月5日 优先权日2012年11月5日
发明者梁如冰, 刘建华 申请人:上海交通大学