专利名称：：一种评价增溶性辅料生物安全性的方法
技术领域：
：本发明涉及一种评价增溶性辅料生物安全性的方法，属于药用辅料领域。具体地，本发明以嗜热四膜虫为生物模型，结合微量量热法，考察增溶性辅料对嗜热四膜虫生长代谢的影响，从而评价增溶性辅料的生物安全性。
背景技术：
：增溶性辅料大多是一类非离子表面活性剂，其结构中既有亲水基团，又有亲油基团，在溶液中可以形成胶束或反胶束，作为增溶剂、乳化剂在难溶药物液体制剂中应用。随着现代液体制剂的改善和提高，以及现代新剂型的出现，增溶性辅料的地位愈显重要。但是增溶性辅料本身及生产储存过程中存在环氧乙烷、二氧六环、2-氯乙醇、二乙二醇等毒性物质残留，是其在应用中安全性问题频发的原因之一，尤其是在注射剂中。现有的安全性评价方法主要通过红细胞悬浮液溶血或凝集等常规药理实验，虽然结果较直观，但判断的主观性较强，误差大，难以实现客观量化评价。嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)是一种淡水中常见的单细胞真核原生动物，不仅具有在绝大多数真核细胞中可见的典型的亚细胞结构，而且与高等动物细胞具有很好的相似性。它无细胞壁，直接通过细胞膜与环境接触，对环境变化能够迅速作出反应，显示出比高等动物细胞更高的敏感性；而且其生长符合典型的微生物生长曲线模型。据此可通过动态生长曲线来分析嗜热四膜虫对所处生长环境中的毒物性质的反应情况。目前嗜热四膜虫已成为生物学和药理学研究、环境安全的监测，以及水生态系统污染物安全毒理学评价的理想材料，但其用于药用辅料、尤其是注射剂增溶性辅料的评价还未见报道。微量量热法具有快速、灵敏、重复性好等特点，能够连续动态地追踪生物体在药物作用下的生长代谢情况，且该方法在密封独立的环境中进行，不易受外界环境影响；在测定微生物、细胞、组织和器官等生物体在生长代谢过程中的微量热变化(吸热或放热)规律方面广泛应用。技术原理嗜热四膜虫的生长、繁殖、衰亡过程中伴随着代谢，有热量释放，释放的热量随生长期的变化关系，即产热功率_时间曲线，称为生物热活性谱(又称"热谱曲线"或"生物效应谱")。在不同药物物质的作用下，该生物效应谱会发生规律性、特征性变化。在既定的条件下嗜热四膜虫的生长与一般微生物生长曲线相似。生长曲线分为四个期，即延滞期、指数生长期、稳定期和衰亡期。指数生长期的嗜热四膜虫生长规律符合指数生长数学模型。Pt=P。exp(kt)或lnPt=lnP。+kt(1)式中，P。为指数生长起点的嗜热四膜虫产热功率，Pt为t时刻的嗜热四膜虫产热功率，k为生长速率常数。同时还可提取最大产热功率(PmaXl，Pmax》、达峰时间(1\，T2)、产热量(Q)等热活性谱的特征参数。
发明内容本发明的目的是提供一种评价增溶性辅料生物安全性的方法。本发明的方法以嗜热四膜虫为模型，结合微量量热法，通过考察增溶性辅料对嗜热四膜虫生长代谢的影响，评价增溶性辅料的生物安全性。所述方法包括以下步骤1)分别取增溶性辅料0.3-10.Omg，加入适量蒸馏水，配成一系列不同浓度的增溶性辅料溶液，无菌条件下，用0.22m滤膜滤过，4t:保存备用；2)在25-37°。恒温条件下，在每个安瓿中，将嗜热四膜虫悬液20-100iiL接种到l-5mL无菌培养基中，接种后优选嗜热四膜虫混悬液的浓度为1000-2500个细胞/mL，分别加入不同浓度的增溶性辅料溶液60-240L，置于微量量热仪中测定嗜热四膜虫生长代谢过程中的产热功率，记录产热功率-时间曲线；3)分析增溶性辅料的不同浓度与产热功率-时间曲线中特征参数或其衍生参数的关系，得到增溶性辅料对嗜热四膜虫生长代谢的促进作用、抑制作用或毒性作用结果，初步评价增溶性辅料的生物安全性；其中，所述特征参数包括生长速率常数、最大产热功率、达峰时间和产热量，所述衍生参数包括抑制率和5%抑制浓度(IC5)。上述方法还可以进一步包括如下步骤4)对步骤3)中所述的特征参数进行主成分分析，提取能够较全面代表产热功率_时间曲线信息的特征参数；5)通过每个主成分的得分系数与其贡献率，建立增溶性辅料的综合评价函数，计算增溶性辅料的得分，综合评价增溶性辅料的生物安全性。其中，步骤1)中所述增溶性辅料优选注射剂增溶性辅料，更优选吐温20、吐温80、聚乙二醇400、聚乙二醇600或泊洛沙姆188;所述更优选的辅料是非离子表面活性剂的典型代表，在医药领域应用较广泛，具有较好地增溶作用；另外，吐温80、泊洛沙姆188等辅料目前已有应用，但由于其质量标准不完善，仍存在潜在的安全隐患，因此有必要对其进行生物安全性评价；所述增溶性辅料溶液的浓度范围为0.3-10.Omg/mL，优选系列浓度0.3mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.Omg/mL、1.2mg/mL，更优选系列浓度0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.Omg/mL、3.0mg/mL、4.Omg/mL，更优选系列浓度1.0mg/mL、4.0mg/mL、6.0mg/mL、8.Omg/mL、10.Omg/mL;步骤2)中优选28t:恒温条件，接种后优选嗜热四膜虫混悬液的浓度为1500个细胞/mL，优选加入增溶性辅料的体积为120iiL。本发明测定了不同增溶性辅料作用下嗜热四膜虫生长代谢的热谱曲线，应用热谱曲线的各特征参数进行评价，考察各增溶性辅料的生物安全性。本发明采用微量量热法考察了不同增溶性辅料对嗜热四膜虫生长代谢的影B向，以生长速率常数(k)、最大产热功率(PmaXl、Pmax》、达峰时间(Tl、T2)和产热量(Q)等生物热动力学特征参数为指标，对增溶性辅料对嗜热四膜虫生长代谢的影响进行了客观的定量评价。建立了以嗜热四膜虫为生物模型，采用微量量热法对增溶性辅料进行生物安全性评价的方法。本发明以增溶性辅料对嗜热四膜虫生长的全面的作用过程，通过对具有整体性特征的热谱曲线进行信息分析，采用反映不同阶段的特征参数，全面、客观量化地考察了增溶性辅料对嗜热四膜虫生长代谢的影响，评价了增溶性辅料的生物安全性。该方法操作简单，有利于检测的规范化。本发明的技术效果在于1)以嗜热四膜虫为模型，结合微量量热法，建立了新的增溶性辅料生物安全性评价方法，对于注射剂增溶性辅料的生物安全性评价具有重要意义。2)该方法在密封独立的环境中进行，干扰小，能够真实动态全面反映增溶性辅料与嗜热四膜虫的相互作用，客观评价增溶性辅料的生物安全性。3)所选的生物模型能够真实表征增溶性辅料的毒性效应，从而为其安全性提供参考依据。4)该方法对嗜热四膜虫混悬液的浓度、加入增溶性辅料的体积以及生长温度等条件进行了优化，有利于准确测定。5)评价的参数全面、客观并且能够量化，自动化操作简单，有利于检测的规范化。6)建立了增溶性辅料对嗜热四膜虫生长影响的综合评价方法。图1为正常条件下嗜热四膜虫生长代谢的产热功率_时间曲线。图2为不同增溶性辅料作用下嗜热四膜虫生长代谢的产热功率_时间曲线。图3为不同增溶性辅料作用下嗜热四膜虫生长速率常数与浓度的关系。图4为各样品的综合评价得分图。具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。1.仪器TAMIII12通道毫瓦级热导式等温量热仪(TA公司，美国)，YXQLS-B全自动立式电热蒸汽灭菌器(上海降拓仪器设备有限公司)，303AB-3型隔水式培养箱(上海树立仪器仪表有限公司)。2.材料与试剂嗜热四膜虫(TetrahymenathermophilaBF5)由武汉大学提供；培养基(取蛋白胨15g、酵母粉5g、葡萄糖lg，溶于1000mL双蒸水中；取5份，每份10mL分装于试管中，12rC灭菌20min，冷却备用)；吐温20(北京市东环联合化工厂，批号960703);吐温80(江苏晨牌药业有限公司，批号9080220);聚乙二醇400(广东汕头市西陇化工厂，批号060908);聚乙二醇600(天津市科密欧化学试剂开发中心，批号2041027);泊洛沙姆188(上海协泰辅料有限公司，批号090309);无菌蒸馏水。3.嗜热四膜虫传代培养取灭菌的培养基，接入200iiL指数生长期的嗜热四膜虫悬液，于28°C培养箱内静止培养4d后进入稳定期，备用。实施例11.供试品制备取5种增溶性辅料，每种辅料分别取0.5mg、1.0mg、2.0mg、3.0mg、4.Omg，精密称定，加入lmL蒸馏水溶解，配制成浓度分别0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.Omg/mL、4.0mg/mL的各增溶性辅料溶液。无菌条件下，用0.22ym滤膜滤过，fC保存备用。2.测定方法采用安瓿法，在28t:恒温条件下，待仪器系统基线稳定后，在每个安瓿中，将50L生长稳定期的嗜热四膜虫悬液接种到2mL无菌培养基中形成混悬液，使嗜热四膜虫悬液的浓度为1500个细胞/mL。加入增溶性辅料溶液120yL，混合均匀，置于微量量热仪中测定嗜热四膜虫生长代谢过程中的产热功率，记录产热功率-时间曲线。待曲线回到基线后结束实验。3.结果3.1正常条件下嗜热四膜虫生长热功率曲线的测定按照上述测定方法项，不加入增溶性辅料(即空白样品)，测定了正常条件下嗜热四膜虫生长代谢的热谱曲线(见图l，其中A-B为延滞期、B-C为指数生长期、C-D为稳定期、D-E为衰亡期)，其符合微生物生长曲线模型。根据式(l)，将平行实验中获得的产热功率-时间曲线上指数生长期的lnPt、t值进行线性拟合，得到嗜热四膜虫(BF5)的生长速率常数k。拟合生长速率常数见表l，结果重现性良好。表1正常条件下嗜热四膜虫生长速率常数测定结果实验组123456生长速率常数k(h一1)0.43350.43020.43470.43650.43520.4325相关系数r0.98530.98540.99180.98780.99130.98863.2不同增溶性辅料作用下嗜热四膜虫生长代谢热谱曲线的测定按照上述测定方法项，分别测定了嗜热四膜虫在不同增溶性辅料作用下的生长代谢热谱曲线，如图2所示。参数测定结果见表2。通过分析可知，随着各增溶性辅料浓度的增大，嗜热四膜虫的生长速率常数降低。其中在吐温80和泊洛沙姆188的部分浓度下，其生长速率常数较正常条件下大，与浓度之间的线性关系较好(P<0.05)。嗜热四膜虫生长传代时间不断增加。第一最大产热功率随增溶性辅料浓度的增加而减小，除吐温80的低浓度外，其与正常条件下嗜热四膜虫的产热功率相比都较小；第二最大产热功率亦随浓度的增加而减小，直至消失。说明增溶性辅料的存在对嗜热四膜虫的生长代谢产生了抑制作用。表2不同增溶性辅料对嗜热四膜虫生长代谢影响的热谱曲线的参数测定结果6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>[OO56]注C表示增溶性辅料浓度；k表示嗜热四膜虫生长速率常数；r表示k值拟合的相关系数；L、T2表示达峰时间；PmaXl、PmaX2表示最大产热功率；1表示抑制率。3.3抑制率和5%抑制浓度(IC5)的测定根据表2中的参数测定结果可知，不同增溶性辅料对嗜热四膜虫的生长抑制不同，故以生长速率为指标对抑制率(I)进行计算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式中，k。为正常条件下嗜热四膜虫指数生长期的生长速率常数，k为增溶性辅料作用下嗜热四膜虫指数生长期的生长速率常数。通过计算，IC5分别为吐温20为0.0407mg/mL，吐温80为1.202mg/mL，聚乙二醇400为0.668mg/mL，聚乙二醇600为1.358mg/mL，泊洛沙姆188为2.402mg/mL。可知相同浓度下，吐温20对嗜热四膜虫指数生长代谢阶段抑制较强，毒性较强。泊洛沙姆188、聚乙二醇600的抑制作用较弱，对嗜热四膜虫指数生长代谢阶段抑制较小，毒性较弱。3.4生长速率常数与增溶性辅料浓度关系指数生长期的生长速率常数k随各增溶性辅料不同浓度的变化趋势见图3。直线拟合方程如下(除原点)，相关系数检验P<0.Ol，各增溶性辅料的浓度与生长速率常数k具有较好的线性关系。吐益20:k=-0.0952c+0.3674r=_0.9711吐益80:k=-0.0542c+0.4709r=_0.9953聚乙二醇400:k=-0.0380c+0.4332r=_0.9801聚乙二醇600:k=-0.0302c+0.4663r=_0.9901泊洛沙姆188:k=-0.0216c+0.4678r=_0.9918随着各增溶性辅料浓度的增加，嗜热四膜虫的生长速率常数都在减小，表明浓度的增加会增大其对嗜热四膜虫的毒性作用。从增溶性辅料浓度与生长速率常数关系曲线斜率的绝对值可知，其毒性作用为吐温20最大，吐温80和聚乙二醇400次之，聚乙二醇600和泊洛沙姆188较小。这表明随着浓度的增加，吐温20对嗜热四膜虫指数生长期毒性的增加较快，聚乙二醇600和泊洛沙姆188的增加较慢。3.5热谱参数的主成分分析由热谱曲线和特征参数可知，不同增溶性辅料对嗜热四膜虫生长代谢的影响存在差异。以XIX6为变量，分别代表参数生长速率常数k、产热功率Q、达峰时间1\、第一最大产热功率Pmaxp达峰时间L、第二最大产热功率Pma^，采用SPSS13.5进行主成分分析，提取能够较全面代表热谱曲线信息的特征参数。由主成分分析的特征参数的初始特征值(InitialEigenvalues)、提取负荷平方的求禾口值(ExtractionSumsofSquaredLoadings)禾口方定转负荷平方禾口(RotationSumsofSquaredloadings)可知，前两个主成分的特征值都大于1，累积贡献率(V)为82.751%，即前两个主成分代表原有参数的82.751%的信息。见表3。表3各样品的综合评价结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由成分负荷矩阵可知，提取了两个主成分，用F表示，其表达式为Fl=0.943X1+0.969X2-0.510X3+0.989X4-0.342X5-0.384X6F2=0.080X1-0.038X2-0.816X3+0.030X4+0.228X5+0.522X6系数的绝对值越大，说明主成分与该参数的关系越密切。因此，第一主成分与Q、k、PmaXl的关系密切，第二主成分与1\和Pmax2的关系密切。两主成分代表了原有6个指标的82.751%的信息。由成分得分系数矩阵可知，两个主成分的表达式如下Zl=0.283X1+0.291X2-0.0153X3+0.297X4-0.103X5-0.115X6Z2=0.049X1-0.024X2-0.500X3+0.019X4+0.507X5+0.320X63.6增溶性辅料对嗜热四膜虫生长影响的综合评价热谱曲线考察的是嗜热四膜虫生长代谢的整体信息，提取的参数也是反映其生长代谢的综合参数。因此，建立一种科学综合的数学模型评价方法。通过每个主成分的得分系数与其贡献率，建立各个样品的综合评价函数，计算每个样品的得分S=V1*Z1+V2*Z2+V3*Z3+...+Vn*Zn式中，S表示样品综合得分；V表示各成分贡献率；Z表各成分的得分。计算各样品的综合分数。结果见表3和图4。由图4可知，与空白相比，泊洛沙姆188得分最高，吐温80和聚乙二醇600次之，吐温20最低。提示我们泊洛沙姆188和吐温80对嗜热四膜虫的毒性较小，吐温20的毒性最大。4.结论结果表明，泊洛沙姆188(02.Omg/mL)、聚乙二醇600(01.Omg/mL)、吐温80(00.5mg/mL)作用下的生长速率常数较空白的值大，对嗜热四膜虫的生长有促进作用。吐温20、聚乙二醇400对嗜热四膜虫的生长有毒性作用，能抑制其生长。在5种增溶性辅料部分低浓度的作用下，产热功率PmaXl、Pmax2较空白值高，在5种增溶性辅料部分高浓度的作用下，产热功率PmaXpPma&较空白值低；无论高浓度还是低浓度，产热量Q都较正常值低。由1(:5、主成分分析和综合得分结果可知，相同浓度下，泊洛沙姆188、吐温80和聚乙二醇600对嗜热四膜虫的毒性较其他小，三者的安全范围较大。综合分析可知，不同增溶性辅料对嗜热四膜虫生长代谢影响不同。通过生长热谱曲线的参数分析，能够较好评价各增溶性辅料的生物安全性。权利要求一种评价增溶性辅料生物安全性的方法，其包括以下步骤1)分别取增溶性辅料0.3-10.0mg，加入适量蒸馏水，配成一系列不同浓度的增溶性辅料溶液，无菌条件下，用0.22μm滤膜滤过，4℃保存备用；2)在25-37℃恒温条件下，在每个安瓿中，将嗜热四膜虫悬液20-100μL接种到1-5mL无菌培养基中，接种后嗜热四膜虫混悬液的浓度为1000-2500个细胞/mL，分别加入不同浓度的增溶性辅料溶液60-240μL，置于微量量热仪中测定嗜热四膜虫生长代谢过程中的产热功率，记录产热功率-时间曲线；3)分析增溶性辅料的不同浓度与产热功率-时间曲线中特征参数或其衍生参数的关系，得到增溶性辅料对嗜热四膜虫生长代谢的促进作用、抑制作用或毒性作用结果，其中所述特征参数包括生长速率常数、最大产热功率、达峰时间和产热量，所述衍生参数包括抑制率和5％抑制浓度；根据结果评价增溶性辅料的生物安全性。2.如权利要求1所述的方法，其进一步包括如下步骤4)对步骤3)中所述的特征参数进行主成分分析，提取能够较全面代表产热功率-时间曲线信息的特征参数；5)通过每个主成分的得分系数与其贡献率，建立增溶性辅料的综合评价函数，计算增溶性辅料的得分；根据结果评价增溶性辅料的生物安全性。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述增溶性辅料为注射剂增溶性辅料。4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述增溶性辅料包括吐温20、吐温80、聚乙二醇400、聚乙二醇600或泊洛沙姆188。5.如权利要求l或2所述的方法，其特征在于，所述增溶性辅料溶液的浓度范围为0.3-10.Omg/mL。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述增溶性辅料溶液的系列浓度为0.5mg/7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述恒温条件为28°C。8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述接种后嗜热四膜虫混悬液的浓度为1500个细胞/mL。9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述加入增溶性辅料的体积为120iiL。全文摘要本发明涉及一种评价增溶性辅料生物安全性的方法。该方法以嗜热四膜虫为模型，结合微量量热法，考察增溶性辅料对嗜热四膜虫生长代谢的影响，评价增溶性辅料的生物安全性。本发明方法通过对具有整体性特征的热活性谱进行信息分析，采用反映不同生长代谢阶段的特征参数，全面、客观量化考察了增溶性辅料对嗜热四膜虫生长代谢的影响，评价了增溶性辅料的生物安全性，操作简单，有利于检测的规范化。文档编号G01N25/20GK101717811SQ20091023716公开日2010年6月2日申请日期2009年11月9日优先权日2009年11月9日发明者张少锋,杨明,肖小河,鄢丹申请人:中国人民解放军第三〇二医院