专利名称：一种应用于转基因作物土壤微生态安全性评价的Biolog ECO微平板技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种应用于转基因作物土壤微生态安全性评价的Biolog ECO微平板技术，属转基因生物安全性评估和微生物生态学领域。
背景技术：
自1983年世界上首例转基因植物获得成功以来，利用基因工程对农作物进行改良和优化后在提高产量、改善农产品营养成分、缩短育种周期、增强抗病虫性等方面均取得了巨大成就。许多转基因作物如玉米、棉花、大豆等已经进入了商业化生产。然而这些转入了外源基因的作物是否会给人们带来不可预料的风险却备受争议，转基因作物的安全问题也是目前国际社会关注的热点。土壤是生态系统中物质循环和能量转化的重要场所，土壤微生物既是土壤有机物质转化的执行者，又是影响植物营养元素活性的重要因素，土壤微生物多样性与活性的保持是农业生态系统健康、稳定的基础。土壤微生物群落功能多样性是描述土壤微生物群落特征的一个重要指标，可以反映土壤状况的重要信息。因此，开展转基因植物对土壤微生物群落功能影响的研究对于科学评价转基因植物的潜在风险具有重要意义。目前研究土壤微生物群落功能主要通过两种方式一种是通过研究土壤酶活性变化来探讨微生物群落功能的变化；另一种是基于“碳源利用水平”的代谢指纹法来研究微生物群落功能。Biolog ECO微平板就是通过微生物对单一碳源的利用情况来了解其微生物的动态，微生物对碳源的利用能力是表征土壤微生物生长情况的主要指标，可用于估价土壤微生物群落代谢多样性和功能多样性的研究。Biolog ECO微平板方法由于操作简便，培养周期短，得到了研究者的青睐，是研究微生物代谢特征的主流方法之一，与DGGE、PLFA等分子手段互为补充、相互印证，被用于评估植物对重金属污染土壤、养殖场土壤、曝气废水处理反应器的修复效果、长期施肥等农田管理措施对土壤微生物的影响等。然而应用此技术评价转基因作物对根际土壤微生物群落功能影响的研究较为匮乏，急需建立完善相关技术体系。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，在其芽孢形成过程中会产生Bt杀虫晶体蛋白，该Bt杀虫毒蛋白又可分为α外毒素、β外毒素、S内毒素和虱因子，其中用于转基因作物的主要是δ内毒素。δ内毒素被靶标昆虫取食后，在中肠的碱性和还原性环境中降解为60kD左右的活性肽，并与昆虫中肠上皮细胞的特异性受体结合，引起细胞膜穿孔，破坏细胞渗透平衡，致使细胞肿胀破裂， 最终导致昆虫瘫痪或死亡。由于Bt毒蛋白对敏感害虫专一性强、效果好，且对人畜安全，因此Bt基因是目前转基因作物研究中应用最广泛的抗虫基因。因此，建立一种适用于评价转Bt基因作物对根际土壤微生物群落功能影响的 Biolog ECO微平板技术，对于完善转基因作物土壤生态安全评价技术体系尤其至关重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种应用于转基因作物土壤微生态安全性评价的Biolog ECO微平板技术，特别是提供一种快捷、敏感地评价转Bt基因植物对根际土壤微生物群落功能影响的研究方法，以解决传统方法工作量繁重、误差大、不全面等问题， 从而将Biolog ECO微平板技术成功应用于转Bt基因作物对根际土壤微生态安全性评价中。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。本发明所述的应用于转基因作物土壤微生态安全性评价的Biolog ECO微平板技术，其工艺流程如
图1所示，具体包括以下步骤1)收集不同生育期的转基因作物、非转基因亲本作物根际土壤样品；2)进行 Biolog ECO 实验；3)平均吸光度(AWCD)及多样性指数的计算；4)主成分(PCA)分析。其中，上述方法中，所述的生育期包括苗期、分蘖期、拔节期、抽穗期、成熟期。所述的转基因作物优选转Bt基因作物，如转Bt基因水稻、转Bt基因棉花。所述的根际土壤样品的收集为称取根际土样(分别为转基因作物或非转基因亲本作物的根际土壤)，放入无菌水中，二者比例为1 99 (g/ml)，室温下在摇床上中速振荡，-20°C保存。所述的Biolog ECO实验步骤为将得到的根际土壤样品溶液从冰箱中取出，进行 1000倍稀释，接种到Biolog ECO微平板，然后放入保湿的无菌塑料容器中恒温培养； 分别在培养对11、4811、7211、9611、12011、14411，测定波长为590nm时，对该微平板进行读数。本发明采用平均吸光度(AWCD)来描述微生物代谢强度，其计算公式如下AWCD = [Σ (Ci-R)]/31其中，Ci是除对照孔外各孔的吸光度值，R是对照孔的吸光度值。AWCD值可用以衡量微生物利用不同碳源的整体能力，通过对一系列读数时间的 AffCD值变化趋势的差异来分析样品间微生物群落代谢功能的不同。由于AWCD值随时间变化的趋势线具有直观可见的特点，这样更易于发现样品间碳源利用能力的差异。本发明所述的多样性指数包括Siannon多样性指数(H' )、Simpson指数⑶、 Mcintosh多样性指数(U)，以及Siarmon均勻度和Mchtosh均勻度，它们的计算公式分别如下H' = - Σ PilnPiD=I-E Pi权利要求
1.一种应用于转基因作物根际土壤微生态安全性评价的Biolog ECO微平板技术，包括以下步骤(1)收集不同生育期的转基因作物、非转基因亲本作物根际土壤样品；(2)进行Biolog ECO 实验；(3)平均吸光度AWCD及多样性指数的计算；(4)主成分PCA分析。
2.根据权利要求1所述的微平板技术，其特征在于，所述的生育期包括苗期、分蘖期、 拔节期、抽穗期、成熟期。
3.根据权利要求1所述的微平板技术，其特征在于，所述的转基因作物优选转Bt基因作物。
4.根据权利要求1所述的微平板技术，其特征在于，所述根际土壤样品的收集如下称取转基因作物或非转基因根际土样，放入无菌水中，二者比例为1 99(g/ml)，室温下在摇床上中速振荡，-20°C保存。
5.根据权利要求1所述的微平板技术，其特征在于，所述的BiologECO实验步骤为 将得到的根际土壤样品溶液从冰箱中取出，进行1000倍稀释，接种到Biolog ECO微平板， 然后放入保湿的无菌塑料容器中恒温培养；分别培养Mh、48h、72h、96h、120h、144h， 然后在测定波长为590nm下，对该微平板进行读数。
6.根据权利要求1所述的微平板技术，其特征在于，所述的多样性指数包括aiarmon多样性指数H'、Simpson指数D、Mcintosh多样性指数U,以及Shannon均勻度和Mcintosh 均勻度。
7.根据权利要求1所述的微平板技术，其特征在于，所述的主成分PCA是指BiologECO 微平板中的31种碳源，分别为胺类、氨基酸、糖类、羧酸类、聚合物类。
8.权利要求1 7任一项所述的BiologECO微平板技术在转基因作物根际土壤微生态安全性评价中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种应用于转基因作物根际土壤微生态安全性评价的Biolog ECO微平板技术，包括以下步骤1)收集不同生育期的转基因作物、非转基因亲本作物根际土壤样品；2)进行Biolog ECO实验；3)平均吸光度AWCD及多样性指数的计算；4)主成分PCA分析。本发明技术可用于评价转基因作物对根际土壤微生物群落功能的影响，并由此评价转基因作物对根际土壤微生态系统的潜在安全风险。
文档编号C12Q1/04GK102251016SQ20111020624
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月22日 优先权日2011年7月22日
发明者唐雪明, 朱宏, 王金斌, 程凯, 赵凯, 魏曼曼 申请人:上海市农业科学院