专利名称：口蹄疫疫苗浓缩纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种口蹄疫病毒疫苗浓缩纯化方法，通过连续流离心机、中空纤维、PEG联合使用，既能浓缩口蹄疫抗原， 又可以使抗原得到纯化。
背景技术：
口蹄疫是由口蹄疫病毒所引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，被国际兽医局(OIE)列为A类传染病之首。疫苗接种是世界上多数国家控制口蹄疫疫病的主要手段。疫苗制造工艺复杂，尤其是抗原处理工艺的选择特别重要，146S抗原是口蹄疫疫苗免疫原性起决定性作用的的抗原，比较脆弱，容易破碎或裂解，会导致免疫原性丧失或下降。口蹄疫灭活疫苗在质量方面存在的主要问题是1.安全性差，动物在注苗后出现不同程度的不良反应，轻者减食或停食2 3天或发生流产，重者发生死亡，原因是疫苗中的非目的蛋白成分高。疫苗中的非目的蛋白包括培养细胞时残留的血清和水解乳蛋白，细胞蛋白和口蹄疫病毒的非结构蛋白。2.疫苗免疫效力不稳定，其表现是，疫苗注射后免疫持续期短，其主要原因是疫苗中有效抗原(146S抗原)含量低。为提高疫苗的免疫效力，通常采用对抗原浓缩的办法，但浓缩的同时，往往将非目的蛋白也浓缩了，导致不良反应增加。同样，为降低不良反应而对疫苗进行纯化时，常规方法的缺点是有效抗原在纯化过程中的损失太大，不良反应得到改善但疫苗的免疫效果却降低了。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效的口蹄疫病毒抗原浓缩纯化的新方法，以解决口蹄疫灭活疫苗安全性与免疫效果不稳定的问题。本发明提供的口蹄疫疫苗浓缩纯化方法，包括以下步骤I)、用连续流离心机除去抗原中大颗粒物质；2)、用中空纤维超滤系统处理步骤I)后抗原液；3)、用PEG6000处理步骤2)后循环液。较佳地，步骤I)中，⑴连续流离心机设定转速为3000 15000转/分，优选为3000 10000转/分，(2)收集离心后的轻液，弃去重液。较佳地，步骤2)中，(I)用于口蹄疫病毒浓缩用中空纤维分子量规格为30K 750K，优选为30K 300K，孔径是O. 25 2. Omm,优选为O. 5 I. Omm, (2)当循环液体积为原液体积的1/50 1/4，优选为1/20 1/10时，收集中空纤维超滤系统的循环液，弃去透过液。较佳地，中空纤维的数量为1000 4000根纤维/支膜柱，用于口蹄疫病毒中空纤维膜柱数是I 24支，优选为2 12支。较佳地，步骤3)中，(I)用于处理口蹄疫病毒抗原的PEG6000的浓度是待处理液的体积的5% 15%，优选为6% 10%。较佳地,步骤3)的具体操作为将PEG6000加入到步骤2)后循环液中，离心、沉淀，收集沉淀液部分，收集量为处理液的1/2 1/2000，优选为1/5 1/1000，弃去轻液，收集沉淀液；加入PBS液。更佳地，在沉淀液中加入的PBS液的PH为7. 4 8. 0，加入PBS液，使终体积量是沉淀液量I. I倍 1000倍，优选为2倍 100倍，即得到目标抗原液。本发明还可以采用用连续流离心机除去抗原中大颗粒物质后即用PEG6000处理的方案，即，所述步骤I)和3)连续也可完成浓缩纯化工作，这样组成的系统可单独使用。前面限定的步骤I)和3)的具体条件在这里同样可以采用。利用本发明提供的口蹄疫疫苗浓缩纯化方法能够兼顾口蹄疫抗原的浓缩和纯化， 制得的口蹄疫疫苗的免疫效果好，不良反应少。
具体实施例方式实施例实施例I : 口蹄疫O型灭活疫苗制造，用口蹄疫O型病毒0ZK/93株和0R/80株分别接种BHK21细胞悬浮培养，收获细胞培养物，分别经二乙烯亚胺(BEI)灭活后，再经以下方法方法处理后，加矿物油佐剂混合乳化制成疫苗，用于预防猪O型口蹄疫。(I)、用连续流离心机除去抗原中大颗粒物质①用连续流离心机,设定转速为3000转/分。②收集离心机排出的轻液，弃去沉淀物(重液)。(2)、用中空纤维超滤系统处理(I)步骤后抗原液①用于口蹄疫病毒浓缩用中空纤维分子量规格为50K,孔径是O. 5mm,数量为3000根纤维/支膜柱，用于口蹄疫病毒浓缩中空纤维系统中空纤维膜柱数是12支。②当循环液体积为原液体积的1/10时，收集中空纤维超滤系统的循环液，弃去上清液。(3)、用PEG6000处理(2)步骤后循环液①用于处理口蹄疫病毒抗原是PEG6000，浓度是待处理液的体积的5%。②将PEG6000加入到⑵步骤后循环液中，离心、沉淀，收集沉淀液部分，收集量为处理液的1/200，弃去上清液，留下沉淀液。③在沉淀液中加入PH为7. 8的PBS液，加入PBS液，使终体积量是沉淀液量100倍，即得到目标抗原液。实施例2 : 口蹄疫O型灭活疫苗制造，用口蹄疫O型病毒0ZK/93株和0R/80株分别接种BHK21细胞悬浮培养，收获细胞培养物，分别经二乙烯亚胺(BEI)灭活后，再经以下方法方法处理后，加矿物油佐剂混合乳化制成疫苗，用于预防猪O型口蹄疫。(I)、用连续流离心机除去抗原中大颗粒物质①用连续流离心机,设定转速为8000转/分。②收集离心机排出的轻液，弃去沉淀物(重液)。(2)、用中空纤维超滤系统处理(I)步骤后抗原液①用于口蹄疫病毒浓缩用中空纤维分子量规格为100K,孔径是I. 5mm,数量为2000根纤维/支膜柱，用于口蹄疫病毒浓缩中空纤维系统中空纤维膜柱数是4支。②当循环液体积为原液体积的1/20时，收集中空纤维超滤系统的循环液，弃去上清液。(3)、用PEG6000处理(2)步骤后循环液①用于处理口蹄疫病毒抗原是PEG6000，浓度是待处理液的体积的10%。②将PEG6000加入到⑵步骤后循环液中，离心、沉淀，收集沉淀液部分，收集量为 处理液的1/4，弃去上清液，留下沉淀液。③在沉淀液中加入PH为7. 8的PBS液，加入PBS液，使终体积量是沉淀液量2倍，即得到目标抗原液。实施例3 : 口蹄疫O型灭活疫苗制造，用口蹄疫O型病毒0ZK/93株和0R/80株分别接种BHK21细胞悬浮培养，收获细胞培养物，分别经二乙烯亚胺(BEI)灭活后，再经以下方法方法处理后，加矿物油佐剂混合乳化制成疫苗，用于预防猪O型口蹄疫。(I)、用连续流离心机除去抗原中大颗粒物质①用连续流离心机,设定转速为5000转/分。②收集离心机排出的轻液，弃去沉淀物(重液)。(2)、用中空纤维超滤系统处理(I)步骤后抗原液①用于口蹄疫病毒浓缩用中空纤维分子量规格为300K，孔径是2. 0mm，数量为1500根纤维/支膜柱，用于口蹄疫病毒浓缩中空纤维系统中空纤维膜柱数是12支。②当循环液体积为原液体积的1/15时，收集中空纤维超滤系统的循环液，弃去上清液。(3)、用PEG6000处理(2)步骤后循环液①用于处理口蹄疫病毒抗原是PEG6000，浓度是待处理液的体积的7%。②将PEG6000加入到⑵步骤后循环液中，离心、沉淀，收集沉淀液部分，收集量为处理液的1/40，弃去上清液，留下沉淀液。 ③在沉淀液中加入PH为7. 9的PBS液，加入PBS液，使终体积量是沉淀液量6倍，即得到目标抗原液。实施例4 : 口蹄疫O型灭活疫苗制造，用口蹄疫O型病毒0ZK/93株和0R/80株分别接种BHK21细胞悬浮培养，收获细胞培养物，分别经二乙烯亚胺(BEI)灭活后，再经以下方法方法处理后，加矿物油佐剂混合乳化制成疫苗，用于预防猪O型口蹄疫。(I)、用连续流离心机除去抗原中大颗粒物质①用连续流离心机，设定转速为10000转/分。②收集离心机排出的轻液，弃去沉淀物(重液)。(2)、用PEG6000处理(I)步骤后轻液①用于处理口蹄疫病毒抗原是PEG6000，浓度是待处理液的体积的10%。②将PEG6000加入到⑵步骤后循环液中，离心、沉淀，收集沉淀液部分，收集量为处理液的1/400，弃去上清液，留下沉淀液。③在沉淀液中加入PH为7. 7的PBS液，加入PBS液，使终体积量是沉淀液量40倍，即得到目标抗原液。实施例5 : 口蹄疫O型灭活疫苗制造，用口蹄疫O型病毒0ZK/93株和0R/80株分别接种BHK21细胞悬浮培养，收获细胞培养物，分别经二乙烯亚胺(BEI)灭活后，再经以下方法方法处理后，加矿物油佐剂混合乳化制成疫苗，用于预防猪O型口蹄疫。(I)、用连续流离心机除去抗原中大颗粒物质①用连续流离心机，设定转速为4000转/分。②收集离心机排出的轻液，弃去沉淀物(重液)。(2)、用PEG6000处理(I)步骤后轻液
①用于处理口蹄疫病毒抗原是PEG6000，浓度是待处理液的体积的6%。②将PEG6000加入到⑵步骤后循环液中，离心、沉淀，收集沉淀液部分，收集量为处理液的1/2000，弃去上清液，留下沉淀液。③在沉淀液中加入PH为7. 8的PBS液，加入PBS液，使终体积量是沉淀液量40倍，即得到目标抗原液。下面说明效果评估方法I、有效抗原含量测定，用蔗糖密度梯度紫外光定量法检测口蹄疫146S抗原含量，检测浓缩前后的146S含量，通过146S抗原含量变化，浓缩后的抗原回收率不低70%。评估为合格。2、蛋白含量测定，用双缩脲法(药典2005版)测定纯化前后的总蛋白含量，纯化后的蛋白去除率不低于90%为合格。3、对疫苗的效力检测，用成年健康易感牛(乳鼠中和抗体滴度< I : 4或细胞中和抗体滴度< I : 8或ELISA抗体效价< I : 8) 30头，分为3组，每组10头。将待检疫苗分为I头份、1/3头份、1/9头份3个剂量组，每型每一剂量组分别于颈部肌肉注射5头动物，分圈饲养。连同对照牛2头，接种口蹄疫病毒强毒O. 2ml (含10000ID50)。连续观察10日。对照动物应3个以上蹄出现病变(水泡或溃疡)，免疫牛仅在舌面出现水泡或溃疡，而其他部位无病变时判为保护，除舌面以外任一部位出现典型口蹄疫病变(水泡或溃疡)时判为不保护。根据免疫牛的保护数，按Reed-Muench法计算被检疫苗的Η)50，每头份疫苗应至少每型口蹄疫各3个TO50。4、对疫苗的抗体合格率及维持时间测定，用10-24月龄的16头牛每头免疫I个剂量，抗体(LP_ELISA，1 64)合格率为不低于60%，免疫持续期不低于180日。5、通过动物试验评价疫苗的不良反应。用30 40日龄的健康易感仔猪(细胞中和抗体滴度彡I 8或乳鼠中和抗体滴度彡I 4或液相阻断ELISA抗体滴度彡I 8)15头，各两侧耳根后肌肉分点注射2头份疫苗，逐日观察14日。怀孕奶牛15头，分点注射4头份疫苗，逐日观察30日，均不应出现因注射疫苗引起的不良反应。利用上述效果评估方法分别检测上述各实施例制得的疫苗，得到如下检测结果(I)有效抗原含量测定实施例I :检测浓缩前后的146S含量，浓缩前2. 16 μ g/ml、浓缩倍数为20倍，浓缩后为30. 7 μ g/ml，抗原回收率为71%。实施例2 :检测浓缩前后的146S含量，浓缩前I. 53 μ g/ml、浓缩倍数为40倍，浓缩后为45. 31^/1111，抗原回收率为74%。实施例3 :检测浓缩前后的146S含量，浓缩前2. 03 μ g/ml、浓缩倍数为60倍，浓缩后为86. 5 μ g/ml，抗原回收率为71%。
实施例4 :检测浓缩前后的146S含量，浓缩前I. 03 μ g/ml、浓缩倍数为100倍，浓缩后为86. 5 μ g/ml，抗原回收率为84%。实施例5 :检测浓缩前后的146S含量，浓缩前3. 02 μ g/ml、浓缩倍数为50倍，浓缩后为122. 3 μ g/ml，抗原回收率为81%。(2)蛋白含量测定实施例I :检测纯化前后的蛋白含量，纯化前蛋白含量为2. 6mg/ml，浓缩倍数为20倍，纯化后总蛋白含量为1. 04mg/ml，蛋白去除率98 %。实施例2 :检测纯化前后的蛋白含量，纯化前蛋白含量为2. 9mg/ml，浓缩倍数为40倍，纯化后蛋白含量为I. 16mg/ml，蛋白去除率99%。实施例3 :检测纯化前后的蛋白含量，纯化前蛋白含量为2. 7mg/ml，浓缩倍数为60倍，纯化后总蛋白含量为3. 24mg/ml，，蛋白去除率98 %。实施例4 :检测纯化前后的蛋白含量，纯化前蛋白含量为2. 7mg/ml，浓缩倍数为100倍，纯化后总蛋白含量为18. 9. mg/ml,，蛋白去除率93%。实施例5 :检测纯化前后的蛋白含量，纯化前蛋白含量为2. 4mg/ml，浓缩倍数为50倍，纯化后总蛋白含量为9. 6mg/ml，，蛋白去除率92 %。(3)对疫苗的免疫效果检测实施例I :每头份疫苗对两个攻毒株0ZK/93株的效力为5. 2PD50, 0R/80株的效力为 5. 2PD50。实施例2 :每头份疫苗对两个攻毒株0ΖΚ/93株的效力为5. 3PD50，0R/80株的效力为 9. 00PD50。实施例3 :每头份疫苗对两个攻毒株0ΖΚ/93株的效力为9. 0PD50, 0R/80株的效力为 15. 59PD50。实施例4 :每头份疫苗对两个攻毒株0ΖΚ/93株的效力为9. 0PD50, 0R/80株的效力为 10. 81PD50。实施例5 :每头份疫苗对两个攻毒株0ΖΚ/93株的效力为10. 81PD50, 0R/80株的效力为 10. 81PD50。(4)对疫苗的抗体及维持时间测定，评价免疫效果实施例I :用10-24月龄的16头牛每头免疫I个剂量，抗体(LP-ELISA，I : 64)合格率为75%，免疫持续期为180日。实施例2 :用10-24月龄的16头牛每头免疫I个剂量，抗体(LP-ELISA，I : 64)合格率为70%，免疫持续期为190日。实施例3 :用10-24月龄的16头牛每头免疫I个剂量，抗体(LP-ELISA，I : 64)合格率为76%，免疫持续期为200日。实施例4 :用10-24月龄的16头牛每头免疫I个剂量，抗体(LP-ELISA，I : 64)合格率为77%，免疫持续期为195日。实施例5 :用10-24月龄的16头牛每头免疫I个剂量，抗体(LP-ELISA，I : 64)合格率为80%，免疫持续期为195日。(5)通过动物试验评价疫苗的不良反应
实施例I :用30 40日龄的健康易感仔猪15头，各两侧耳根后肌肉分点注射2头份疫苗，逐日观察1 4日。怀孕奶牛15头，分点注射4头份疫苗，逐日观察30日。未出现不良反应。实施例2 :用30 40日龄的健康易感仔猪15头，各两侧耳根后肌肉分点注射2头份疫苗，逐日观察14日。怀孕奶牛15头，分点注射4头份疫苗，逐日观察30日。均未出现不良反应。实施例3 :用30 40日龄的健康易感仔猪15头，各两侧耳根后肌肉分点注射2头份疫苗，逐日观察14日。怀孕奶牛15头，分点注射4头份疫苗，逐日观察30日。均未出现不良反应。实施例4 :用30 40日龄的健康易感仔猪15头，各两侧耳根后肌肉分点注射2头份疫苗，逐日观察14日。怀孕奶牛15头，分点注射4头份疫苗，逐日观察30日，出现短暂产奶下降，3日后恢复。均未出现不良反应。实施例5 :用30 40日龄的健康易感仔猪15头，各两侧耳根后肌肉分点注射2头份疫苗，逐日观察14日。怀孕奶牛15头，分点注射4头份疫苗，逐日观察30日。均未出现不良反应。
权利要求
1.口蹄疫疫苗浓缩纯化方法，包括以下步骤 1)、用连续流离心机除去抗原中大颗粒物质； 2)、用中空纤维超滤系统处理步骤I)后抗原液； 3)、用PEG6000处理步骤2)后循环液。
2.根据权利要求I所述的口蹄疫疫苗浓缩纯化方法，其特征在于，步骤I)中，(I)连续流离心机设定转速为3000 15000转/分，(2)收集离心后的轻液,弃去重液。
3.根据权利要求I所述的口蹄疫疫苗浓缩纯化方法，其特征在于，步骤2)中，(I)用于口蹄疫病毒浓缩用中空纤维分子量规格为30K 750K，孔径是O. 25 2. Omm, (2)当循环液体积为原液体积的1/20 1/4时，收集中空纤维超滤系统的循环液，弃去透过液。
4.根据权利要求3所述的口蹄疫疫苗浓缩纯化方法，其特征在于，中空纤维的数量为1000 4000根纤维/支膜柱，用于口蹄疫病毒浓缩的中空纤维膜柱数是I 24支。
5.根据权利要求I所述的口蹄疫疫苗浓缩纯化方法，其特征在于，步骤3)中，(I)用于处理口蹄疫病毒抗原的PEG6000的浓度是待处理液的体积的5% 15%。
6.根据权利要求I所述的口蹄疫疫苗浓缩纯化方法，其特征在于，步骤3)的具体操作为将PEG6000加入到步骤2)后循环液中，离心、沉淀，收集沉淀液部分，收集量为处理液的1/5 1/2000，弃去轻液，收集沉淀液；加入PBS液。
7.根据权利要求6所述的口蹄疫疫苗浓缩纯化方法，其特征在于，在沉淀液中加入的PBS液的PH为7. 4 8. 0，加入PBS液，使终体积量是沉淀液量I. I倍 1000倍，即得到目标抗原液。
8.口蹄疫疫苗浓缩纯化方法，其特征在于，用连续流离心机除去抗原中大颗粒物质后即用PEG6000处理。
9.根据权利要求8所述的口蹄疫疫苗浓缩纯化方法，其特征在于， 用连续流离心机除去抗原中大颗粒物质的步骤中，(I)连续流离心机设定转速为3000 15000转/分，(2)收集离心后的轻液，弃去重液； 用PEG6000处理的步骤中，(I)用于处理口蹄疫病毒抗原的PEG6000的浓度是待处理液的体积的5% 15%，具体操作为将PEG6000加入到处理液中，离心、沉淀，收集沉淀液部分，收集量为处理液的1/5 1/2000，弃去轻液，收集沉淀液；加入PBS液。
全文摘要
本发明提供了一种高效的口蹄疫病毒抗原浓缩纯化的新方法，其包括以下步骤1)、用连续流离心机除去抗原中大颗粒物质；2)、用中空纤维超滤系统处理步骤1)后抗原液；3)、用PEG6000处理步骤2)后循环液。利用本发明提供的口蹄疫疫苗浓缩纯化方法能够兼顾口蹄疫抗原的浓缩和纯化，制得的口蹄疫疫苗的免疫效果好，不良反应少。
文档编号A61P31/14GK102631673SQ20121011228
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者任伟, 张翀宇, 张龙, 徐师军, 李 荣, 郭建军, 陈九连, 魏学锋 申请人:金宇保灵生物药品有限公司