用配方
[0028] 考虑到口蹄疫疫苗用于偶蹄动物，可能和其他制剂混合使用，且不能引起副反应， 药用配方仅限上述，用于口服、鼻内、肌肉的口蹄疫疫苗免疫用途。
【附图说明】
[0029] 图1为口蹄疫病毒标记疫苗规模化生产的流程图；
[0030] 图2为口蹄疫病毒标记疫苗规模化生产的质控方法和质控点。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0032] 实施例1 口蹄疫全病毒颗粒标记抗原的制备
[0033] 包括以下步骤：
[0034] a) 100000L生物反应器全悬浮培养BHK-21细胞，细胞密度达到3-5X106/毫 升时，按照病毒感染复数Μ0Ι0. 01-0. 1接种口蹄疫病毒细胞适应株（猪口蹄疫病毒/ Mya98-XJ-2010株，内蒙古必威安泰生物科技有限公司制备），制备病毒原液，搅拌速度不 超过40rpm，培养4天收获病毒液，使用制备型低速连续流离心机离心除去细胞碎片，同时 收获上清和沉淀，沉淀在〇. 2% Triton-X-100存在的条件下裂解口蹄疫病毒感染细胞和细 胞膜碎片，反复冻融3次后、超声3次（最大输出功率3X 30s);用制备型低速连续流离心 机离心收集上清液，合并上清液，其中口蹄疫病毒滴度为多107_°l〇gTCID 5(l/mL ;
[0035] b)核酸酶解；
[0036] 经步骤a)的病毒液，依次经过0. 8 μm、0. 45 μm、0. 22 μm的滤膜过滤和截留值 100,000-300,000MWC0的膜包或中空纤维柱10倍超滤；
[0037] 高度特异、高活性的核酸酶Benzonase按20-50 X 103单位/升加入到病毒裂解液 中，2-8°C作用9-18小时；其中口蹄疫病毒滴度为107_°-10 8_°l〇gTCID5Q/mL ;
[0038] c)深层过滤和超滤、强阴离子交换；
[0039] 经步骤b)的病毒液，经0. 22 μ m膜过滤，通过Q Sepharose XL离子交换吸附床或 吸附膜，1000毫升介质处理40-50ml的病毒液，洗液为含有90mM氯化钠的4. 7mM磷酸钠缓 冲液（PH6. 5-7. 0)，用含0. 35M氯化钠的120mM的磷酸钠和ImMEDTA的缓冲液（pH7. 5)分步 洗脱；其中口蹄疫病毒滴度为107_°-108_°l〇gTCID 5(l/mL ;
[0040] 病毒裂解液经过滤和超滤除去了小分子量的物质，再经核酸酶消化大分子的病毒 RNA以及细胞RNA，在多数情况下，阴离子交换树脂除去病毒液中的宿主细胞DNA或核酸，一 些阴离子介质包括但不限于DEAE纤维素、DEAE琼脂糖、DEAE生物胶、DEAE葡聚糖。
[0041] d)PEG沉淀、氯仿抽取；
[0042] 经步骤c)的病毒液用PEG-8000或PEG-6000沉淀，PEG-8000或PEG-6000配成 40%的贮存液，6. 2mM磷酸钠、ImMEDTA缓冲液配制5M氯化钠，本实施例中经核酸酶消化、层 析纯化洗脱的病毒液用PEG-8000沉淀，使PEG-8000在病毒液里的浓度4 % (W/V)，氯化钠 浓度在100mM，剧烈搅拌后2-8°C 1小时，制备型离心机以IOOOg离心10分钟，倒去上清， 用含120mM氯化钠、6. 2mM磷酸钠 、ImMEDTA (pH7. 5)缓冲液重悬沉淀，体积为病毒培养液的 10-20 %〇
[0043] 上述的病毒收获液作为口蹄疫病毒原液，加入抽提液，所述抽提液是通过将三氯 甲烷和异戊醇按24 : 1体积比混合后得到的，使大量的口蹄疫病毒颗粒停留在水相和水乳 界面。病毒原液加入等体积的抽提液，上下混合1分钟，用制备型带有多管转头的离心机在 20°C条件下3, OOOrpm离心10分钟，收获水相，对界面进行2次抽提，合并水相获得口蹄疫 病毒抽提液。其中口蹄疫病毒滴度为107_°-10 8_°l〇gTCID5(l/mL ;
[0044] e)灭活；
[0045] 0· 025%二乙烯亚胺，4°C灭活48小时或37°C灭活2小时
[0046] f)蔗糖密度梯度离心纯化；
[0047] 步骤e)的原液一步连续流蔗糖等密度梯度超速离心纯化，所用离心机为生产制 备型系列，大容量转头容积为3. 2-8升，批处理抽提液2000升；口蹄疫病毒灭活液采用密度 梯度超速离心，超速离心方式为连续流，梯度为不连续梯度，包括（1)离心力36000-60000g 形成的梯度；（2)90000-120000g形成的梯度；（3)蔗糖梯度和口蹄疫灭活液的总体积为8L， 灭活液中有微量的BHK-12细胞杂质和前段步骤中的残余；(4) 口蹄疫病毒灭活液的流速 IOL/小时；步骤g)所用平衡缓冲液为0. 04M PBS(pH 7. 2-7. 6)，60%蔗糖用缓冲液（0. 04M 磷酸，100禮似(：1，0.1%1'1^〇111-100，？!17.6)配制，转子注入1.6升配好的60%蔗糖溶 液；以20升/小时上样，处理口蹄疫病毒PEG沉淀重悬液2000升，转速32000rpm ;
[0048] g)超滤透析、稀释、除菌过滤
[0049] 步骤f)原液经超滤透析并浓缩25-50倍，浓缩后的原液经0. 22 μ m膜除菌过滤；
[0050] i)原液储备或乳化配制；
[0051] 原液储备或经稀释乳化配制，乳化采用的佐剂为V201。
[0052] 口蹄疫病毒标记疫苗规模化生产流程图及质控方法和质控点如图1和图2所示， 其中，具体的口蹄疫病毒标记疫苗规模化生产过程中各步骤的质量控制指标制如下表1所 不O
[0053]
【主权项】
1. 一种口蹄疫全病毒颗粒疫苗组合物，其特征在于含有口蹄疫病毒的全病毒颗粒以及 稳定冷冻保护剂，所述的稳定冷冻保护剂由以下物质组成：多元醇、缓冲溶液以及非离子表 面活性剂。
2. 如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于含有口蹄疫病毒的全病毒颗粒1-20微 克/mL，多元醇10-50% (v/v)，非离子表面活性剂0. 003-0. 03mg/mL以及IO-IOOmM的缓冲 溶液，疫苗pH介于7. 0和9. 0之间。
3. 如权利要求1或2所述的疫苗组合物，其特征在于所述的多元醇为甘油、聚乙二醇以 及聚氧丙烯甘油醚中的至少一种。
4. 如权利要求1或2所述的疫苗组合物，其特征在于所述的聚乙二醇为聚乙二醇300 或聚乙二醇400。
5. 如权利要求1或2所述的疫苗组合物，其特征在于所述的非离子表面活性剂为吐 温-20或土温-80。
6. 如权利要求1或2所述的疫苗组合物，其特征在于所述的缓冲溶液是磷酸缓冲液、 Tris缓冲液或HEPES缓冲液的一种或几种的混合物。
7. 权利要求1-6任一项所述的疫苗组合物在制备预防或治疗口蹄疫疾病药物中的应 用。
【专利摘要】本发明公开了一种口蹄疫全病毒颗粒疫苗组合物及其制备方法和应用。本发明的一种口蹄疫全病毒颗粒疫苗组合物，含有口蹄疫病毒的全病毒颗粒以及稳定冷冻保护剂，所述的稳定冷冻保护剂由以下物质组成：多元醇、缓冲溶液以及非离子表面活性剂。本发明提供的稳定冷冻保护剂，使疫苗抗原稳定，保护标记疫苗的效价和效果；在生产过程和冷链过程中保护标记疫苗抗原稳定或标记抗原库的抗原稳定，可在液体、冷冻的条件下较长时间保持标记抗原的效价或活性。
【IPC分类】A61K47-26, A61K47-34, A61P31-14, A61K39-135
【公开号】CN104548085
【申请号】CN201410749503
【发明人】张澍, 吕宏亮
【申请人】吕宏亮, 张澍, 内蒙古必威安泰生物科技有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月9日