单个基因mRNA甲基化水平检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于单个基因 mRNA甲基化水平检测 方法及所用引物。
【背景技术】
[0002] RNA甲基化修饰发现于1974年，是一种最常见的转录后水平修饰，大约占全部RNA 修饰的三分之二。在真核生物中，最常见的mRNA转录后修饰是发生在碱基A第6位N原子 上的甲基化修饰，m6A大约占细胞mRNA全部腺苷含量的0. 1 % -0. 4%，即哺乳动物中平均每 一条mRNA含有3-5个6-甲基修饰的腺苷。m6A甲基化位点主要发生在高度保守的RRACH (R =G，A ;H = A，C，T)序列中，在表观遗传中可能发挥重要的作用，但由于m6A修饰方式并没有 破坏碱基之间的配对，故无法通过直接的测序对其进行基因组上的定位，同时由于缺乏有 效的检测分析手段，相关的研究一直停滞不前。直到2012年，文献相继报道鉴定出FTO和 ALKBH5等是RNA去甲基化的修饰酶类，METTL3、METTL14等是RNA的甲基化酶，这促使RNA 甲基化成为一种重要的表观遗传学标记，结合FTO超表达的小鼠被检测到各组织RNA甲基 化水平明显升高，且容易发生肥胖，ALKBH5缺失的小鼠生殖器RNA甲基化水平降低，睾丸发 育迟缓，精子形态异常这些现象，提示mRNA甲基化具有潜在的生物学意义，其分子机制有 待进一步研究。不同基因 mRNA甲基化水平存在差异，可能影响mRNA剪切、出核转运、稳定 性及翻译效率对具体的生物学过程产生作用，因此对单个基因 mRNA甲基化水平的测定，可 以进一步对其功能进行深入研究。
[0003]目前仅有的测定mRNA甲基化的方法是基于特异识别m6A抗体的免疫沉淀的二代 测序，但此方法成本高昂且耗时，因此建立价格低廉、简单易操作的单基因甲基化相对水平 检测方法非常重要。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种检测单基因甲基化水平的方法。发明人通过 设计mRNA甲基化特异引物，提取组织RNA并进行片段化，利用甲基化的免疫沉淀及荧光定 量PCR等检测手段建立单基因甲基化水平检测平台，为探索mRNA甲基化水平与其生物学功 能奠定基础。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种单个基因 mRNA甲基化水平检测方法中 所用的引物；
[0006] 靶基因为C/ΕΒΡα基因，
[0007] 引物为：
[0008] C/EBP a -P2 F gacacggtgcgtctaagatgag
[0009] C/EBPa -P2 R tcggagcggtgagtttgc〇
[0010] 本发明还同时提供了单个基因 mRNA甲基化水平检测方法，包括以下步骤：
[0011] 1)、设计靶基因甲基化区域的荧光定量引物：根据NCBI上提供的靶基因 mRNA全长 序列，在涵盖⑶S区结束段及3' UTR区甲基化高度保守的RRACH (R = G，A ;H = A，C，T)序 列区域设计荧光定量PCR引物（为多对荧光定量PCR引物）；
[0012] 2)、提取总RNA，用化学断裂法将总RNA片段化为RNA片段（100~500nt之间）；
[0013] 备注说明：可利用RNA变性凝胶电泳检测RNA片段化成功且未降解；RNA变性电泳 检测属于常规技术；
[0014] 3)、将步骤2)得到的片段化的RNA通过特异性识别m6A的抗体将带有m 6A位点的 所有mRNA片段沉淀下来；并用琼脂糖磁珠进行收集富集；
[0015] 备注说明：
[0016] 特异性识别 m6A 的抗体，即为：Affinity purified anti_m6A rabbit polyclonal antibody (Synaptic Systems, cat. no. 202 003)；
[0017] 洗脱提纯后检测mRNA浓度，Dot Blot方法检测到含m6A的mRNA片段特异性富集 (如图3)。
[0018] 4)、将步骤3)中抗体富集得到的mRNA片段反转录，用步骤1)的荧光定量PCR引 物进行实时荧光定量PCR，即可得到含甲基化的靶基因相对表达量，相对表达量的高低就代 表了单个基因 mRNA甲基化水平高低。
[0019] 作为本发明的单个基因 mRNA甲基化水平检测方法的改进：
[0020] 靶基因为C/ΕΒΡα基因，
[0021] 引物序列如下：
[0022] C/EBP a -P2 F gacacggtgcgtctaagatgag
[0023] C/EBPa -P2 R tcggagcggtgagtttgc。
[0024] 作为本发明的单个基因 mRNA甲基化水平检测方法的进一步改进：
[0025] 步骤2)的化学断裂法中，
[0026] RNA片段化体系为：
[0027] RNA(1 μ g/μ 1)180 μ 1，
[0028] 片段化缓冲液（10Χ) 20 μ I ;
[0029] 孵育温度和时间为以下任意一种：
[0030] 70。(：、3111丨11，70。(：、5111丨11(较佳），95。(：、3111丨11(较佳）和95。(：、511^11。
[0031] 本发明的方法是一种单个基因 mRNA甲基化相对水平检测技术，该方法的独特之 处在于从生物组织RNA样品中，通过m6A免疫沉淀和荧光定量PCR技术，可以测定单个基因 甲基化相对水平。
[0032] 本发明用带有m6A位点的基因片段mRNA表达量来计算靶基因 mRNA甲基化水平。 由于目前并不存在直接测定基因甲基化水平的方法，因此本方法可实现单个基因甲基化相 对水平检测。
[0033] 本发明采用甲基化特异性引物进行荧光定量PCR，得到靶基因 mRNA甲基化水平表 达量，通过与Input比较，计算得到革El基因的甲基化相对水平。
【附图说明】
[0034] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0035] 图1 :不同水浴温度和时间条件下的RNA片段化效果；
[0036] 图2 :凝胶电泳证实C/EBP α引物的有效性；
[0037] 图3 :m6A特异性抗体进行各组mRNA片段化富集（Dot blot检测）；
[0038] 图4 :样品1和样品2的C/EBP α基因 mRNA甲基化相对水平；
[0039] 样品1:21日龄猪的肝脏组织，样品2:180日龄猪的肝脏组织。
【具体实施方式】
[0040] 实施例1、
[0041] 1.总 RNA 提取：
[0042] 分别取两组猪肝样品各50~IOOmg进行以下操作：液氮中研磨后，加 Iml Trizol 裂解液混勾，加入0. 2ml氯仿剧烈振荡15秒，室温下孵育IOmin后，4°C、15000g离心15min， 吸取上层水相（约500 μ 1)转移到新管中，加入500 μ 1异丙醇，颠倒混匀；4°C，15, OOOg离 心lOmin，弃上清；加入1ml 75% (体积％ )乙醇洗涤，4°C，15, OOOg离心10min，弃上清， 待管底RNA沉淀变成无色透明时，加入80 μ 1的DEPC水吹打混匀。
[0043] 2. RNA 片段化：
[0044] 1)按以下反应体系将步骤1所得的RNA与片段化缓冲液混合，
[0045] RNA片段化体系
[0047] 为获得最佳温度和孵育时间，分别设置70°C *3min，70°C *5min，95°C *3min和 95°C *5min四种条件。
[0048] 该片段化缓冲液（IOX)为：800 μ L RNase-free 水，100 μ L IM Tris-HCl 缓冲液 (pH = 7. 0)，100 μ L IM ZnCl2溶液。
[0049] 2)反应结束后立即加入20 μ 1浓度为0. 5Μ的EDTA溶液，在冰上迅速冷却以终止 反应，剧烈振荡15秒；依次加入550 μ 1预冷的无水乙醇，77 μ 1浓度为3M的醋酸钠溶液， 15 μ 1 (质量浓度为2% )的糖原溶液。1000 g离心Imin后于-80°C冰箱沉淀过夜（12小 时）。
[0050] 3)沉淀过夜的RNA于4°C、15000g离心25min后收集沉淀，弃上清，加入1ml 75% (体积％ )乙醇洗涤，4°C，15, OOOg离心10min，弃掉上清，待管底的RNA沉淀变无色透明时， 加入50 μ 1的DEPC水，并吹打混匀。
[0051 ] 4)变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA片段化效果：电泳条件为恒压60V，电泳30min~ lh。以步骤1中提取的总RNA作为对照，结果表明：在70°C*5min和95°C*3min条件下，RNA 片段化效果较好，断裂的RNA片段大小在100~500nt之间（图1)，可以用于后续实验。
[0052] 3.引物设计：
[0053] 以猪的C/EBP α基因为例，根据在NCBI上提供的该基因 mRNA全长序列，在⑶S区 末尾及3' UTR区的甲基化特异性序列（RRACH)上下游设计多对荧光定量PCR引物，由上海 生工生物有限公司合成，引物序列如下：
[0054] C/EBP α -P2 F gacacggtgcgtctaagatgag
[0055] C/EBP a -P2 R tcggagcggtgagtttgc
[0056] 用于筛选的扩增体系和扩增程序如下：
[0057] 引物采用 IOul 的 PCR扩增体系，BP :5ul 2xTaq PCR MasterMix(含染料），0· 5 μ 1 C/EBP a -P2F，(λ 5 μ I C/EBP a -P2R，1 μ 1 猪肝 cDN