牛a型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组疫苗及其制备方法和应用的制作方法

牛a型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组疫苗及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组疫苗及其制备方法和应用，属于兽用疫苗研究领域。本发明采用“抗原化抗体”策略以及全新的反向疫苗操作学技术和策略，将与我国接壤国家最近流行的牛A型口蹄疫病毒的代表性毒株的优势抗原表位进行合理的串联后，与牛IgG重链恒定区偶联，克隆入原核表达载体构建重组表达载体，转化大肠杆菌感受态细胞表达重组抗原并采用Ni-NAT层析柱纯化后，经Bio-Rad蛋白定量试剂盒定量后单独或与重组口蹄疫病毒3D蛋白配伍后制备疫苗，动物免疫试验结果显示，该重组蛋白或配伍后的疫苗均能够刺激机体产生高效价的保护性抗体，同时保护免疫动物抵抗同源病毒的攻击，具有良好的应用前景。
【专利说明】牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组疫苗及其制备 方法和应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种牛A型口蹄疫疫苗及其制备方法和应用，尤其涉及一种牛A型口 蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组疫苗及其制备方法和应用，属于兽用疫苗研究领域。

【背景技术】
[0002] 口蹄疫作为主要经济畜种猪、牛和羊的重大动物疫病不仅严重威胁畜牧业的健康 发展，而且涉及动物源性食品安全以及其外贸出口。一旦发生疫情损失惨重，政治影响恶 劣。灭活疫苗在防控FMD中发挥十分重要的作用，但由于生产此类疫苗存在生物安全隐患， 需要区分疫苗免疫和自然感染动物（DIVA)。为此，1991年后欧盟成员国禁止使用灭活疫苗 进行疫情防控，美国也禁止在其本国生产和使用灭活疫苗。
[0003] 我国拥有漫长的国际边界线，与中亚，南亚，东亚等口蹄疫多发地区的国家接壤， 这些地区经常发生不同血清型口蹄疫流行，给我国口蹄疫防控造成了巨大的压力，曾发生 多起口蹄疫病毒传入我国引起疫情的事例。因此，为了防止国外毒株通过边境交叉放牧，活 畜及其产品走私造成外源性病毒的引入，除了加大疫情监控外，研制能防控外来流行毒株 的新型疫苗显得尤为重要，为我国防控口蹄疫外来毒株传入提供优质安全高效的新型疫苗 储备。
[0004] 采用分子生物学，蛋白组学及反向疫苗学等相关技术研发安全高效的新型FMD疫 苗已经成为热点课题。迄今，已经通过分子生物学技术研制的口蹄疫新型疫苗并申报国 家专利的有猪〇型口蹄疫重组疫苗申获了专利（上海复旦大学郑赵鑫教授研制)，并获得农 业部颁布的"一类新兽药证书II，遗憾的是该产品至今没有商品化。本实验室研制的牛 和羊口蹄疫Asial型多表位疫苗经动物免疫效力试验证实具有良好的免疫原性，且已申 获专利，发明名称分别为"牛口蹄疫病毒Asial型重组多表位疫苗及其制备方法"（专利 号：ZL200910259363. 6)和"羊口蹄疫病毒Asial型多表位疫苗及其制备方法"（专利号： ZL200910224025. 9)〇
[0005] 如今，利用反向疫苗学技术研制新型疫苗已经成为未来疫苗发展的趋势。传统灭 活疫苗生物安全的不确定性加速了研究口蹄疫新型疫苗的进程。值得一提的是，近年来通 过增加 T细胞表位和自身蛋白分子作为载体蛋白明显改善了重组抗原的免疫原性，增强了 免疫效果。同时解决了多表位广谱抗原基因的多次串联后表达效率低下的技术瓶颈，不仅 能获得大量高纯度靶标蛋白，而且也能保证所表达靶标蛋白的免疫原性，这为研制口蹄疫 广谱多表位疫苗，防止由于抗原谱单一导致免疫失败提供了很好的技术支持和理论依据。
[0006] 本研究采用分子生物学技术以及先进的设计理念，设计涵盖并合成了与我国接壤 国家最近分离的牛口蹄疫病毒A型代表毒株的优势抗原表位序列，研制针对外来流行毒株 的广谱多表位疫苗，这对于防止国外口蹄疫毒株传入我国具有重要的意义，为我国防控外 来毒株疫情提供疫苗战略储备。


【发明内容】

[0007] 本发明的目的之一在于提供一种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组抗 原，该抗原涵盖了与我国接壤国家最近流行的牛A型口蹄疫病毒的代表性毒株的优势抗原 表位；
[0008] 本发明的目的之二在于提供所述重组抗原在制备牛A型口蹄疫疫苗中的应用；
[0009] 本发明的目的之三在于提供一种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位疫苗，其 含有本发明所述的重组抗原。
[0010] 为了达到所述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0011] 本发明的一种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组抗原，其特征在于所述 的重组抗原是将与我国接壤国家最近流行的牛A型口蹄疫病毒的代表性毒株的优势抗原 表位进行串联后，与牛IgG重链恒定区偶联后构建得到，所述的重组抗原含有以下（a)或 (b)所示的氨基酸序列：
[0012] (a) SEQ ID N0 :6所示的氨基酸序列；或
[0013] (b)将SEQ ID N0 :6所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失 或插入而获得的仍具有抗原表位功能的蛋白衍生物。
[0014] 在本发明的一个具体实施例中，所述的重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID N0 :6所 /_J、1 〇
[0015] 编码所述的重组抗原的核苷酸序列，其特征在于具有以下（a)、（b)或（c)所示的 核苷酸序列：
[0016] (a) SEQ ID N0 :5所示的核苷酸序列；或
[0017] (b)编码SEQ ID N0 :6所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或
[0018] (c)编码具有抗原表位功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，该蛋白衍生物通过将SEQ ID N0 :6所示的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入而获得。
[0019] 在本发明的一个具体实施例中，所述的核苷酸序列如SEQ ID N0 :5所示。
[0020] 含有本发明所述的核苷酸序列的重组表达载体以及含有该载体的宿主细胞也在 本发明所保护的范围之内。
[0021] 进一步的，本发明还提出了本发明所述的多表位重组抗原在制备预防牛A型口蹄 疫疫苗中的应用。及
[0022] 所述的核苷酸序列在制备预防牛A型口蹄疫疫苗中的应用。
[0023] -种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位疫苗，其特征在于含有本发明所述的 多表位重组抗原。
[0024] 优选的，所述的多表位疫苗还含有口蹄疫病毒3D蛋白的全长氨基酸序列，所述的 口蹄疫病毒3D蛋白的全长氨基酸序列如SEQ ID N0 :8所示。
[0025] 本研究采用"抗原化抗体"策略以及全新的反向疫苗学技术和策略，将与我国接壤 国家最近流行的牛A型口蹄疫病毒的代表性毒株的优势抗原表位进行合理的串联后，与牛 IgG免疫刺激片断（IgG重链恒定区）偶联，克隆入原核表达载体如pET-30a ( + )构建重组 表达载体，转化大肠杆菌感受态细胞(例如BL21，BL21 (DE3)，BL21 (DE3) pLys系列等）表达 重组抗原并采用Ni-NAT层析柱纯化后，经Bio-Rad蛋白定量试剂盒定量后单独或与重组口 蹄疫病毒3D蛋白配伍后制备疫苗，动物免疫试验结果显示，该重组蛋白或疫苗配伍均能够 刺激机体产生高效价的保护性抗体，同时保护免疫动物抵抗同源病毒的攻击，因而本发明 具有良好的应用前景。

【专利附图】

【附图说明】
[0026] 图1为重组表位抗原单独或与3D蛋白联合免疫豚鼠效力试验结果；结果显示，在 加强免疫后，抗原单独或与3D蛋白联合免疫豚鼠均能诱导机体产生高水平的中和抗体，第 二次加强免疫后血清抗体效价进一步升高，显示出该抗原具有良好的免疫原性；
[0027] 图2为重组抗原免疫牛实验结果；结果显示，重组抗原能够诱导宿主动物产生口 蹄疫特异性中和抗体，加强免疫后，保护性抗体水平进一步升高。

【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0029] 实施例1牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组抗原的制备
[0030] 1、A型口蹄疫病毒VP1基因的生物信息学分析：
[0031] 口蹄疫病毒结构蛋白VP1是病毒的优势抗原，无论是分离纯化的天然VP1蛋白还 是重组表达产物都能诱导机体产生保护性中和抗体，具有型特异性。A型口蹄疫病毒VP1基 因全长有639个核苷酸，编码一条213个氨基酸组成的蛋白，其主要抗原表位集中在140 -160位氨基酸和200 - 213位氨基酸区段。本研究用DNAStar生物软件对与我国接壤一些国 家最近分离的牛A型口蹄疫病毒代表毒株（NCBI登录号：FJ755067, HQ666886和AY59371) 进行序列分析，确定了优势抗原表位为135 - 160位氨基酸，并确定以200 - 213位氨基酸为 另外一个B抗原表位，同时添加了 VP1区21 - 28位的保守氨基酸序列为T细胞表位。
[0032] 2、基因克隆及其蛋白表达，纯化
[0033] 多表位重组抗原基因的设计及其合成：为了防止在构建基因时出现新表位，在相 邻两表位之间引入能保证各个表位结构正确展示的间隔子序列GGGS，多表位基因的串联 顺序为 21-28-135-160 (FJ755067) -135-160 (HQ666886) -140-160 (AY59371)- 200-213 (FJ755067)，并在基因的5' -端和3' -端分别引入特异性酶切位点如BamH I和 EcoR I，多表位基因委托生工生物工程(上海）股份有限公司合成，多表位重组抗原基因序 列如SEQ ID NO. 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。将合成的多表位基因 和原核表达载体pET-30a ( + )分别用BamH I和EcoR I酶切，纯化回收后插入用相应酶线 性化pET-30a ( + )载体，构建重组表达载体pRE，转化JM109感受态进行阳性筛选，通过序列 测定确定阳性重组子。
[0034] 牛IgG重链恒定区基因（CIgG)的PCR扩增：用primer5· 0引物软件设计扩 增牛IgG重链恒定区基因全长的特异性引物，正链：5-AAGACGGCCCCATCGGT-3,负链： 5-TTTACCCGGAGTCTTGGA-3,获得全长为987kb的目的基因，牛IgG重链恒定区核苷酸序列如 SEQIDN0. 3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0. 4所示，然后用带有酶切位点的特异性 引物 Cattle IgG HC Hind III，5-aagcttgcGCCTCCACCACAGCCCCGAAA-3;Cattle IgG HC xho 15-ctcgagcTTTACCCGCAGACTTAGAGGTGGAC-3 对目的基因进行扩增、纯化、回收，用 Hind III / xhol双酶切后，插入相应酶切线性化的重组表达载体pRE构建重组表达载体pRECIgG，经酶 切、PCR及序列测定为阳性后-20°C保存备用。
[0035] 重组蛋白的表达及其生物活性鉴定：将阳性重组表达载体转化BL21 (DE3) (Novagen)，挑选单克隆接种LB培养液（Kan+)经IPTG诱导表达及表达形式鉴定后，大规模 化表达重组蛋白，即从LAB平板上挑单菌落接种5ml含卡那霉素的LB培养液，于37°C培养 箱220rmp过夜培养，将过夜培养物按1%加入新制备的无菌LB培养液中（kan+)，于37°C 培养箱220rmp培养至0D600 ~ 0. 4?0. 6时，于超净台无菌条件下加入0. 4mM的IPTG 诱导表达4?6小时，2000rpm离心30min收获培养物，按原培养物体积的20%加入蛋白 裂解液，冰浴条件下进行超声破碎处理（30min)，20000g离心20min收集沉淀（4°C )，弃上 清。按照Ni-NTA组氨酸纯化柱（Novagen)说明书纯化蛋白，纯化蛋白经SDS-PAGE电泳及 Westernblotting分析，重组蛋白RECIgG大小与预期相符，能与FMDV (A型)感染血清及辣 根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG发生免疫反应，说明表达的重组蛋白具有生物活性。
[0036] 表达的重组蛋白即为本发明所述的牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组 抗原，其氨基酸序列如SEQ ID N0. 6所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID N0. 5 所示。
[0037] 实施例2牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位疫苗的制备及免疫效力分析
[0038] 1、疫苗制备：
[0039] 纯化蛋白经Bio-Rad定量试剂盒定量后稀释成适当的浓度，单独或与纯化的3D蛋 白全长片段(氨基酸序列如SEQ ID N0. 8所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID N0. 7所示） 与重组抗原按1:2 (V/V)配置后，加入等体积的油佐剂ISA206 (France)乳化成疫苗制剂。
[0040] 2、豚鼠免疫效力试验：
[0041] 用制备的疫苗，按每只豚鼠0. 2ml经肌肉途径接种豚鼠（20 μ g抗原或20 μ g抗原 +10 μ g3D蛋白)分别免疫5只豚鼠，免疫实验结果显示，无论是重组抗原单独还是与3D蛋白 联合免疫豚鼠均能刺激机体产生特异性抗体和高效价的FMDV保护性抗体，值得注意的是， 加强免疫后14天，血清特异性抗体效价和中和抗体效价明显升高，提示具有良好的免疫效 果，第二次加强免疫后血清特异性中和抗体效价继续升高（图1)。用1000ID50WH/09毒株进 行攻击，结果4/5动物完全保护。提示该疫苗能够针对国内毒株提供免疫保护，具有良好的 免疫效果。
[0042] 3、牛体免疫效力试验
[0043] 用制备的疫苗，按每头份2ml经肌肉途径接种免疫牛（500 μ g抗原或500 μ g抗原 +250 μ g3D蛋白）分别免疫5头无口蹄疫特异性抗体及非结构蛋白抗体健康牛。结果显示， 无论是重组抗原单独还是与3D蛋白联合免疫豚鼠均能刺激机体产生特异性抗体和高效价 的FMDV保护性抗体，加强免疫后14天，血清特异性抗体效价和中和抗体效价明显升高，提 示具有良好的免疫效果（图2)。免疫动物注射部位没有出现红肿、发热等现象，也没有出现 接种不良反应，食欲正常，精神状态良好，提示我们制备的牛A型口蹄疫多表位疫苗具有良 好的免疫原性，免疫豚鼠体后能够产生高水平的保护性抗体，接种后对免疫动物安全无害， 是一种具有广阔前景的新型疫苗，将对我国牛A型口蹄疫防控提供物质储备及技术支撑， 具有重要的意义。
[0044] 4、病毒中和试验
[0045] 根据0ΙΕ (陆生动物手册2005版本）微量中和试验方案，测定牛免疫血清中和本 实验保存多株A型毒株（WH/09, XJKT58以及A型标准毒株）的效能，结果显示，免疫血清能 够中和多种毒株，中和抗体效价为阳性（>1:64)，根据国家标准，提示该疫苗具有良好的免 疫效力和较好的广谱性。
[0001] 序列表 <11〇>中W农业科学院兰州兽医研究所 <120>牛A Μπ蹄疫围外流行毒株广谱多表位重组疫苗及其制备方法和应用 <130> KLPI13D185 <170> Patentln 3. 5 <210> i <211> 342 <212> DNA <213〉多表位承组抗原基W序列 <400> 1 gcjatccig'a.ifa cacag^ttca ^^q-a'rqtcc.c gGtqctcigct ctaqg二actc cacaair.tgcft 60 <jgt-v|qcac{afi jq^gcgacct j'gggt'::匕ctt gcQ-ycqcggy ^cqccqcaca 'ji/tac-ccayc 120 <：fgtggtggct ctaagtacto cgcqgotaqt cjcgcqcacac <：|i：jgqcgacct qciggcacfctt 1 c|cqf^cqcycq Lo^-jc y.jL L jo Luce gc： Lqo Lgqcl clq-^L .cqaq acqaqqcqaL Z40 ctqqqqlccc tc^cqa^qcq aqtcqcqaoa caacLtcc ta ctqqtqqctetaqaeae 30^ aagcagaaaa tfa_tt:gcccc: tgcaaagci.o ctootggaat tc 342 <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213>多农位重组抗原基因编码氨基酸序列 <400> 2 1 Gly Ser Glu Thr Gin Val Gin Arg Arg His Gly Gly Gly Ser Arg 16 Tyr Ser Thr Thr Gly Gly Gly Arg Arg Gly Asp Leu Gly Sor Leu 31 Ala Ala Arg Val Ala Ala Gin Leu Pro Ser Gly Gly Gly Ser Lys 46 Tyr Ser Ala Ala Ser Gly Arg Thr Arg €ly Asp Leu Gly Gin Leu 61 Ala Ala Arg Val Ala Ala Gin Leu Pro Ala Gly Gly Gly Ser Gly 76 Ser Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Thr Arg Val Ala Thr 9丄 Gin Leu Pro Ala Gly Gly Gly Ser Arg His Lys Gin Lys lie lie 106 Ala Pro Ala Lys Gin Leu Leu Glu Phe x210> 3 <211> 987 <212> DNA <213>卞IgG重链恒定区核贳酸序列 <400> 3 gcctccacca cagccccgaa agtcte.ccct ctgagttctt gc^gcggqga caagtccagc 60 tccaccgtga ccctgggctg cctggtctcc agctacazgc ccgagccgqt gaccgt.gacc 120 t g r i a ? c f. c g g g t j o nr.tg a 3 gageggegf g c.acancf cgqccqtccf t cagtcr.tcc 1 i^O
[0002] aqgclc Laca cLcLcagcag caLgglyacc g Lgcacgyca goacc Lcayg acagaccLLc 240 aactgcaacg t.agcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaaggctgt. f.gaf.cncana 300 tqcaaaccat caccctgtga ctgttgccca ccccctgagc tccccggagg accctctqtσ 360 ttcatcttcc caccgaaacc caaggacacc ctcacaatct cgggaacgcc cgaggtcacg 420 tgiigtggtg'g tggac^『tggg ccacgatgac cccgaggtga agttctcctg gttcgrtggac 480 aacgtggagg taaacacagc cacgacgaag ccgagagagg agcagttraa cagcacctac 540 cgcgtggtca gcgccctgctf catccagcac cagqactgga ctggaggaaa gc：agttcaag 600 Lqcaayg LurJ acaacqaayy ccLcccyacc cccaLcqLga qyaccdLcLc caqgalcaaci 660 ccggπcπ ggg^ gccgr:a ggf gt a 1-g 1~ η n t:ggπr:r:<?a c nc:cag(ja习 ga (jr-1oa gc:a a a 720 aqcacggtca gcctcacctg catcrgtGacg agcttctacc caqactacat cgccgtggag 780 tggcagagaa acgggcagcc tgagtcggag gacaagtacg gcacgacccc gccccagctg 040 gccgccgaca gctcctactt cctgtacagc aagctcaqgg tggacaqgaa cagctggcag 900 gaaggagacg cctacacgtg tgtggtgatg cacgaggccc tgcacaatca ctacacgcag 960 aagtccacct ctoaqtctgc gggtaaa 987 <210〉 4 <211〉 329 <212> FRT <+213>屮IgG ,?链恒定区基㈨编码氨基酸序列 <400> 4 1 Ala Sor Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Lou Scr Scr Cys Cys 16 Gly Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser 31 Ser Tyr 駆T Pm Γτ--? Pro Va] Thr Va.1 Tlir Trp Asn Ser (lly Ala 46 Leu Lys Ser Gly Yal His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser 61 Gly Leu Tyr Thr Leu Ser Ser MET Val Thr Val Pro Gly Ser Thr 76 Ser Gly G]n Thr Phe Tlir Cys Ann Val Ala His Pj;q Ala Ser Sej：· 91 Thr Lys Val Asp Lys Ala Val Asp Pro Thr Cys Lys Pro Ser Pro 106 Cys Asp Cys Cys Pro Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val 121 Phe lie Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Thr lie Ser Gly 136 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly His Asp Asp 151 Pro Glu Val Lys Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val Asn 166 Thr Ala Thr Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr 181 Arg Val Val Ser Ala Leu Ai'g lie Gin His Gin Asp Trp Thr Gly 196 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu Pro Ala 211 Pro lie Val Arg Thr lie Ser Arg lie Lys Gly Pro Ala Arg Glu 226 Pro Gin Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gin Glu Glu Leu Ser Lys 241 Ser Thr Val Ser I.en Thr Cys MET Val Thr Ser Phe Tyr Pro Asp 256 Tyr lie Ala Val Glu Trp Gin Arg Asn Gly Gin Pro Glu Ser Glu 271 Asp Lys Tyr Cly Thr Thr Pro Pro Gin Leu Ala Ala Asp Ser Ser 286 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp Gin 301 Glu Gly Asp Ala Tyr Thr Cys Val Val MET His Glu Ala Leu His 316 Asn His lyr 'rkr Gin Lys Ser Thr Ser L> 7s Ser A丄a Gly Lys
[0003] <210> 5 <2il> 1335 <212： DXA <213:-多表位苺因与牛IgG连接：《因序列 <細、5 gqat*-〇/aga cacaggttca gcgacgtcac ggtggtggct ctaggtactc Gacaactggt 60 Γ{Γ|^?_|Γ?ι；τ，7^β qqcjqc.q^r,ot qijggt:ci"<^t:t. cjt'ijqcg'cririg t oqc.rc^za ca ijct'^-ici'caijr: ? 20 ycjtgq t，jgct ctaagtactc cgcggctagt ggg*jgcacac q>.79gcgacct ggggcaqct 1； in〇 gcggcgcgcg tcgccgccca ciottcctgcc ggtggtggct ctggt togag acgaggcgat Z4.0 L'1:g：jgqt i:cgriyaogcg agfcgugar.a 0,-id.c11 cl：tq c tqytyghgg r.L citcigar.ar. 5 00 aaqcaqaaaa ttattqccc c t q c a a aq c a a 1"- c r； t q qa at. tcqcctccac cacacrccccq 3f〇 aaagtctacc ctctgagttc ttgctgcggg gacaagtcca gctccaccgt gacccirgggc 420 LgccLggLcL ccayclacaL gccagagccg g LyaccgLga fjcLygaacLc yyqL：.f- jccLg 480 aaqagcggcg tgcacacctt cccggccgtc cttcagtcct ccgggctcta cactctcagc 540 agcatggtga ccgtgcccgg cagcacctca ggacagacct tcacctgcaa cgtagcccac 6U0 ccggccagca gcaccaaggt ggacaaggct gttgatccca catgcaaacc atcaccctgt c :60 gactgttgcc caccccctga gctccccgga ggaccctctg tcttcatctt. cccaccgaaa 720 cccaaggaca ccct.nacaaf ct.ccjggaacg cccgaggfca cgt.gl:gf.ggt ggt_ggacgt:g 78() ggccacgatg accccgagqt gaagttctcc tgqttcgtgg acgacgtqga ggtaaacaca 840 qccacgacga agccgagaga ggagcagttc aacagcacct accgcgtggt cagcgccctg 900 cgca hccagc a oca riqact.g ga chggagga aa^qagf.t.oa aqt'.ricaaqgt: ocaoaacgaa ^ f.O ^qcctocc^ ccoccatc.^t qaqqaccaLc tccacfqatca aaq.^co^qc ccqq^aqocq 1020 caygtqtatg tcclggoccc accocaggaa qaactcagc.a aaagcacggt cagoctcacc 10B0 tgnatg^jt：i：'a nragcftnta ccr-aga^t.-ic atngr:cjfgg jgcagaj aaanyjijcaij 1140 cctriaqtcqq aqqacaaqta cqqcacqacc ccqccccaqc tqqccqocqa caqctcctac 1200 ttcctgtaca g c a a get c ag g g t: g g a c a g g a a r: n get gc n g g a aag (i cgcctacacg 1260 LyLyLyyLqa Lqcacqaqqc cclycLtcaaL .^qaciy Lcc.^c cLcLLtaqLcL 1320 gcqggtaaac tegag 1335 <210> 6 <211〉 445 <212> PRT <213〉多表位基因与牛IgG连接基因序列编码的氨基酸序列 <400> 6 1 Gly Ser Glu Thr Gin Val Gin Arg Arg His Gly Gly Gly Ser Arg 16 Tvr Ser Thr Thr Gly Gly Gly Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu 31 Ala Ala Arg Val Ala Ala Gin Leu Pro Ser Gly Gly Gly Ser Lys 46 Tyr Ser Ala Ala Ser Gly Arg Thr Arg Gly Asp Leu Gly Gin Leu 61 Ala Ala Arg Yal Ala Ala Gin Leu Pro Ala Gly Gly Gly Ser Gly 76 Ser Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Thr Arg Val Aia Tlxr 91 Gin Leu Pro Ala Gly Gly Gly Ser Arg His Lys Gin Lys lie lie 106 Ala Pro Ala Lys Gin Leu Leo Glu Phe Ala Ser Thr Thr Ala Pro
[0004] 121 Lys Yal Tyr Pro Leu Ser Ser Cys €ys Gly Asp Lys Ser Ser Ser 136 Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Scr Ser Tyr MET Pro Glu Pro 151 Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser Gly Val His 166 Thr Phe Pio Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Ser 181 Ser MET Val Thr Val Pro Gly Ser Tin- Ser Gly Gin Ihr Fhe Thr 196 Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Ala 211 Val Asp Pro Thr Cys Lys Pro Ser Pro Cys Asp Cys Cys Pro Pro 226 Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Lys 241 Pro Lys Asp Thr Leu Thr lie vSer Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys 25B Val Val Val Asp Val Gly His Asp Asp Pro Glu Val Lya Phe Ser 271 Trp Phe Val hsp Asp Val Glu Val Asn Thr Ala Thr Thr Lys Pro 28Θ Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu 301 Arg lie Gin His Gin Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys 316 Lys Val His Asri Glu Gly Leu Pro Ala Pro lie Val Arg Thr Tie 331 Ser Arg lie Lys Gly Pro Ala Arg Glu Pro Glu Val Tyr Val Leu 346 Ala Fro Fro Gin Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Val Ser Leu Thr 361 Cys MET Val Thr Ser Phe Tyr Pro Asp Tyr lie Ala Val Glu Trp 376 Gin Arg Asn Gly Gin Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyi' Gly Thr Thr 391 Pro Pro Gin Leu Ala Ala Asp Ser Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys 406 Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp Gin Gin Gly Asp Ala Tyr Thr 421 Cys Val Val MET His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 436 Sor Thr Sor Lys Scr Ala Gly Lys Leu Glu <210> 7 <211> 1410 <212> DNA <2i3> Π 蹄疫病毐3D全K:基闪的核昔酸序列 <400> 7 ggattgatag utgacaccag agatgttgag gagcgcgtgc atgtcatgcg caaaaccaag 60 ctcgcaccca ctgtggcaca cggtgtgttt aaccctgaat tcgggcctgc cgcc^tgtcc 120 aacaaagacc cgcgcctgga tgaaggagtt grcctcgatg aagccatctt ctccaaacac 130 aagggagaca caaagatgtc tgaggaggac aaagcgctgt cccgccgctg ege二geegae 240 ?tacgcgtcgc gtctgcacag cgtgctgggt acggcaaacg ccccactgag catcracgag 300 gcaattaagg gegtegaegg acttgacgcc auggaaccag acaccgcgcc cggrcttccc 360 tqggctctcc aggggaaacg ccgtggtgcg ctcattgact tcgagaacqg cacrgtcgga 420 cccgaggtta aacctgcctt agagctcatg gagaaaagag agtacaagtt tgca~gccaa 430 accttcctga aggaegagat tcgcccgatg gaaaaggtac gtgccggc.ag gac~cgcatt 540 gtcgacgcct rgcctgttga acacattctt 二acaccagga tgatgattgg caga~tctgt 6D0 gctcaaatgc actcaaacaa cggaccgcaa autggetegg cggttggttg caaucctgat 660 gttgattggc aaagatttgg cacacatttt gctcagtaca gaaacgtgtg gga^gtegae 720 tattcggcct utgatgccaa ccactgcagt gacgcaatga acatcatgtt tgaggaggtg 780 t.tcaacacgg acttcggttt ccacccaaac gct.gagtgga tccfcgaaaac tctcgtgaac 340 actgaacacg cctatgagaa caaacgcatc actgttgagg gegggatgee atcrggttgt 900 tccgcaacaa gcatGatcaa cacaattttg aacaatatct aegtgeteta cgcc~tgcgt 9S0 agacactatg agggagttga gctggacact tacaccatga tetettaegg agacgacatc 1020
[0005] g二ggrtgcaa gtgatcacga tctggacttt gaggccctca agcc二cactr caaatccctt 1080 ggtcaaacca tcactccagc cgacaaaagc gacaaaggtt ttqtzczzgg tcactccatc 1140 accgatgtca ctttcctcaa aagacacttt cacatggatt atggaactgg gttttaGaaa 1200 cctg~gatgg cttcgaagac cctcgaggct atcctctcct ttgcacgccg tgggaccata 1260 caggagaagt tgatctccgt ggcaggactc gccgrccact czggacczqa cgagtaccgg 1320 cgtcrcrttg agcctttcca gggcctcttt gagattccaa gctacagatc actttacctg 1380 cgttgggtga acgccgtgtg cggtgacgca 1410 <210> 8 <211> 470 <212> PRT <213〉口蹄疫病毒3D全因编码的氨基酸序列（31)C) <400> 8 Gly Lgu lie Val /\sp Thr Arg Asp Val Glu Glu Arg Val His Val 15 MET Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val Ala His Gly Val Phe 30 Asn Pro Glu Phe Gly Pro Ala Ala Leu Ser Asr； Lys Asp Pro Arg ?5 Leu Asp Glu Gly Val Val Leii Asp Glu Ala lie Phe Ser Lys His 60 Lys Gly Asp Thr Lys MET Ser Glu Glu Asp Lys Ala Leu Ser Ai'g 75 Arg Cys /Ua Ala Asp Tyr /Ua Ser Arg HI s Ser Vsl Leu frl j 90 Thr Ala Asn Ala Pro Leu Ser lie Tyr Glu Ala lie Lys Gly Val 105 Asp Gly Leu Asp Ala MET Glu Pro Asp Thr Ala Pro Gly Leu Pro 120 Trp Ala Leu Gin Glv Lys Arg Arg Gly Ala Leu lie Asp Phe Glu 135 Asn Gly Thr Val Gly Pro Glu Val Lys Ala Ala Leu Glu Leu Μ? 150 Glu Lys Arg Glu 1'yr Lys Phe Ala Cys Gin Thr ] 3he Lei! Lys Asp 165 Glu lie Arg Pro MET Glu Lys Val Arg Ala Gly Arg Thr Arg lie ISO Val Asp Ala Leu Pro Val Glu His He Leu Tyr Thr Arg MET MX 195 He Gly Arg Phe Cys Ala Gin MET His Ser Asn Asn Gly Pro Gin 210 lie Gly Scr Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Yal Asp Trp Gin Arg 225 Phe Gly Thr His Phe Ala Gin Tyr Arg Asn Val Trp Asp Val Asp 240 Tyr Ser Ala Phe Asp Ala Asn His Cys Ser Asp Ala MET Asn He 255 MET Phe Crlu Glii Val Phe As?^ Thr Asp Phe Gly Phe His Pro Asn 270 Ala Glu Trp He Leu Lys Thr Leu Yal Asn Thr Glu His Ala Tyr 285 Glu Asn Lvs Arg Tie Thr Val Glu Gly Gly MET Pro Ser Gly Cys 300 Ser Ala Thi' Ser lie lie Asn Thr He Leu Asn Asn lie Tyr Val 315 Leu Tyr Ala Leu Arg Arg His Tyr Glu Gly Val Glu Leu Asp Thr 330 Tyr Thr Ι?ΕΤ lie Ser Tyr Gly Asp Asp He ￥al Val Ala Ser Asp 345 His Asp Leu Asp Phe Glu Ala Leu Lys Pro His Phe Lys Ser Leu 360 Gly Gin Thr Tie Thr Pro Ala Asp Lys Ser Asp I.ys Gly Phe Val 375 Leu Gly His Ser He Thr Asp ￥al Thr Phe Lea Lys Arg His Phe 390 His MET Asp Tyr Gly Thr Cly Phe Tyr Lys Pro Val MET Ala Ser 405 Lys Thr Leu Glu Ala He Leu Ser Ph^ Ala Arg Arg Gly Thr lie 420
[0006] Gin Glu Lys Leu lie Ser Val Ala Gly Leu Ala Val His Ser Gly 435 Pro Asp Glu Tyr Arg Arg Leu Phe Glu Pro Phe Gin Gly Leu Phe 450 Glu lie Pro Ser Tyi' Ai'g Ser Leu Tyr Leu Arg Trp Val Asn Ala 465 Val Cys Gly Asp Ala
【权利要求】
1. 一种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组抗原，其特征在于所述的重组抗原 是将与我国接壤国家最近流行的牛A型口蹄疫病毒的代表性毒株的优势抗原表位进行合 理串联后，与牛IgG重链恒定区偶联后构建得到，所述的重组抗原含有以下（a)或（b)所示 的氨基酸序列： (a) SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列；或 (b) 将SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插 入而获得的仍具有抗原表位功能的蛋白衍生物。
2. 如权利要求1所述的重组抗原，其特征在于所述的重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO :6所示。
3. 编码权利要求1所述的重组抗原的核苷酸序列，其特征在于具有以下（a)、(b)或（c) 所示的核苷酸序列： (a) SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列；或 (b) 编码SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或 (c) 编码具有抗原表位功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，该蛋白衍生物通过将SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入而获得。
4. 如权利要求4所示的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所 /_J、1 ο
5. -种重组表达载体，其特征在于含有权利要求3或4所述的核苷酸序列。
6. -种宿主细胞，其特征在于含有权利要求5所述的重组表达载体。
7. 权利要求1或2所述的多表位重组抗原在制备预防牛Α型口蹄疫疫苗中的应用。
8. 权利要求3或4所述的核苷酸序列在制备预防牛A型口蹄疫疫苗中的应用。
9. 一种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位疫苗，其特征在于含有权利要求1或权 利要求2所述的多表位重组抗原。
10. 如权利要求9所述的牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位疫苗，其特征在于还含 有口蹄疫病毒3D蛋白的全长氨基酸序列，所述的口蹄疫病毒3D蛋白的全长氨基酸序列如 SEQ ID NO :8 所示。
【文档编号】C12N15/63GK104119443SQ201310146236
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2013年4月24日 优先权日:2013年4月24日
【发明者】邵军军, 常惠芸, 陈建文 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所