制剂，依次用〇· 45 μπι的Durapore滤器、0· 22 μπι Durapore滤器澄 清，加入Η)ΤΑ使其终浓度为2mM ;使用500kDa超滤器浓缩15倍，用10倍体积的透析缓冲 液1透析，透析产物用25 μ g/ml核酸内切酶在4°C下处理18h，再用0. 45 μL?的Durapore 滤器、〇· 22 μ mDurapore滤器依次澄清过滤，滤液上样Sephacryl S-400HR分子筛层析，分 子筛洗脱液为缓冲液1，洗脱液用〇. 22 μ m Durapore滤器过滤，过滤的洗脱液用Sephadex G25层析柱缓冲液换液，上样到Q-S印harose XL粒子交换层析柱，用线性0-300mM NaCl梯 度液洗脱，洗脱液用500kDa滤器浓缩10倍并用30倍体积的透析缓冲液2透析，透析液用 0· 22 μ m Durapore滤器过滤，_70°C保存使用；
[0050] 其中，所述的透析缓冲液1含150mM NaCl、20mM HEPES，pH 8. 0 ;所述的分子筛层 析的洗脱液含300mM NaCl，20mM HEPES，pH 8. 0 ;所述的S印hadex G25层析柱缓冲液含20mM HEPES，pH 8. 0 ;所述的透析缓冲液2含IlmM磷酸钾、25mM柠檬酸钠、pH 7. 2的218mM蔗糖 液；
[0051] (8) 口蹄疫病毒样颗粒疫苗的配制
[0052] 将口蹄疫病毒样颗粒加入佐剂V206乳化配制成口蹄疫病毒样颗粒疫苗。
[0053] 根据FMDV在哺乳类细胞上的组装，发现了表达P12A，而不是P12A3C，且含自我组 装标签可大量表达、组装近似自然的FMDV VLP颗粒，建立了真正口蹄疫病毒样颗粒的标准。 对FMDV结构蛋白基因进行了改造和突变，FMDV VLP疫苗成功可成功用BHK-21细胞进行了 无血清培养的制备，但FMDV VLP疫苗按生物技术药物要求，在真核细胞BHK-21规模化表 达面临许多技术挑战。特别是涉及转染的BHK细胞整合FMDV基因稳定性以及细胞遗传稳 定性，最终涉及FMDV病毒样颗粒疫苗的安全性，涉及产量低而造成生产成本高的挑战。为 进一步建立低廉、保真、可控FMDV疫苗生产工艺，本发明公开了重组杆状病毒AcMNPV-FMDV 0mP12A转染昆虫细胞Sf21制备FMDV VLP的方法。当Sf21细胞用标准无血清培养基 Sf-900II培养时，FMDV的结构蛋白VPO没有彻底酶解，观察形成VLP少，这和BHK-21表达 形成VLP阳性的细胞裂解液对照的结果一样，在分辨率5. 3A°的电镜下确定FMDV VLP冷 冻电镜图，确证了 VPO、VPI、VP3多克隆抗体的特异性。表明在BHK-21和Sf 21细胞中形成 了 FMDV VLP。定量ELISA(qELISA)检测VLP的定量极限值LOQ = 2ng/mL，Sf21培养的上 清中没有检测到阳性信号。AcMNPV-FMDV 0mP12A感染Sf21细胞的胞质超薄切面的投射电 镜观察到30 - 35nm直径颗粒，小于杆状病毒核衣壳蛋白的电子密度，类似BHK-21细胞出芽 形成FMDV VLPs，Sf21细胞阴性对照无此颗粒发现。这种杆状病毒表达重组的VLP衣壳蛋 白可能包含BHK-21FMDV衣壳蛋白，揭示在昆虫细胞的胞质中有可能阻止病毒样颗粒出芽 到培养上清的机制或分子。
[0054] 补充胆固醇的生长培养基反复培养转染的Sf21细胞形成了标准的杆状病毒感染 工艺，FMDV的出芽生殖不依赖胆固醇，揭示Sf21细胞或培养条件通过出芽机制影响FMDV Pl的衣壳蛋白VP0、VP1、VP3的构象和稳定性。
[0055] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0056] (1)本发明建立了类似自然真正FMDV VLP标准和建立了无血清悬浮培养生产口 蹄疫病毒样颗粒亚单位疫苗的方法。通过重组口蹄疫病毒病毒样颗粒在BHK-21细胞上表 达组装、纯化、乳化，在动物上诱导了抗口蹄疫病毒感染攻击的保护性免疫。本发明提供方 法生产的口蹄疫病毒颗粒具有良好的抗原性，能被口蹄疫病毒抗血清中和。本发明提供方 法生产的口蹄疫病毒病毒样颗粒抗原纯度高，收率高、抗原损失小，适合规模化口蹄疫病毒 样颗粒疫苗的生产。
[0057] (2)本发明提供了一容易操作、规模化、无血清悬浮培养用昆虫细胞生产重组口蹄 疫亚单位疫苗的平台技术。真核细胞制备病毒衣壳蛋白，在培养基pH 7. 0-7. 4时衣壳蛋白 浓度提高，但此pH超出了昆虫细胞生长培养基和Sf 21细胞稳定性要求，本发明对培养基进 行改良，通过Sf21细胞长时间在高pH细胞的适应培养，驯化获得一昆虫细胞变种（SfHpH)。 这种高pH适应的细胞能够在维持正常细胞培养并转入适宜哺乳动物细胞培养的pH范围 7. 2-7. 4,用此细胞生产口蹄疫病毒样颗粒，产量高出母本细胞Sf21的11倍。SfHpH制备 的VLPs可用层析方法纯化。纯化获得的病毒样颗粒大小和结构类似标准BHK-21表达的 VLP。SfHpH细胞表达的VLP制备疫苗免疫动物，刺激抗口蹄疫病毒抗体产生，结果显示：IgG 抗体滴度、中和抗体滴度和BHK-21制备的VLP疫苗免疫产生的反应无显著差异。这表明这 种高pH适应昆虫细胞可用于口蹄疫病毒样颗粒的疫苗生产。
【附图说明】
[0058] 图1为口蹄疫病毒重组结构蛋白抗原性图，其中，1:P12A3C ;2:P12A ;3:VP0 ;4:细 胞蛋白；5:iFMDV ;
[0059] 图2为口蹄疫病毒重组结构蛋白组装的病毒样颗粒图；
[0060] 图3为重组口蹄疫病毒样颗粒免疫口蹄疫牛血清识别图。
【具体实施方式】
[0061] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0062] 实施例1 口蹄疫病毒病毒传染性cDNA克隆
[0063] I. 1细胞系和病毒
[0064] BHK-21细胞系由内蒙古必威安泰生物科技有限公司保存，培养用培养基为 MEM+10%牛血清。原代牛胸腺细胞（Primary bovine thyroid，BTY)来自1岁小牛胸腺， 用MEM+10%牛血清培养基维持和培养。细胞培养驯化口蹄疫病毒OSFS 2014(FMDV/0/ Mya98-XJ-2010疫苗株），取自内蒙古必威安泰生物科技有限公司质量控制部，用作制备 cDNA克隆。
[0065] 1.20 SFS 2015 全长 cDNA 克隆
[0066] 用快速定点试剂盒（Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit，购自美国 Stratagene盒）进行4轮定点突变，在质粒pGEMR-7Zf (-)(购自美国Promega公司）多克 隆位点形成NdeI、NheI、N〇tI、SpeI限制酶切位点，每一轮反应完成后的突变修饰质粒经测 序确证嵌入酶切位点的正确性，并为下一轮定点突变的模板。EcoRI酶切位点是质粒原有的 用于原始不加修饰突变的克隆。
[0067] 用Trizol试剂（购自Invitrogen，USA)从纯化p-OBFS悬液提取RNA，直接PCR合 成cDNA，引物见表1。
[0068] 表1. FMDV OSFS全长传染性cDNA克隆引物 L/1N 丄UD丄乙Λ I /
[0070] 注：酶切位点和T7启动子序列下划并加重。
[0071] 所有引物以中国0型口蹄疫病毒株序列（GenBank Accession Νο:ΑΥ593815)为模 板，设计合成。FMDV特异性引物和Thermoscript逆转录酶（购自美国Invitrogen公司）用 于cDNA第一链合成，然后用Pfu Turbo DNA多聚酶（购自美国Stratagene公司）进行PCR 扩增。以上所有程序均按厂商提供的说明书操作。用表1含适当限制性酶切位点引物扩增 含全长基因组的四个片段。用OlF和OlR引物扩增的片段1(01 ;~lkb，l-980nts)，在Y 末端和Y末端分别有NdeI和NheI酶切位点，OlF引物也含NdeI酶切位点下游的T7RNA多 聚酶启动子。在片段013'末端引入一无声突变使含有NheI酶切位点（977G到T，979C到G， 980A到C)。同样用02F和02R引物扩增，获得片段2(02 ;~2kb ;980nts-3024nts)，在5' 末端和Y末端分别有Nhel和Notl酶切位点。用03F和03R引物扩增，获得片段3 (03 ;~ 2. 4kb ;3024nts-5443nts)，在Y末端和Y末端分别有NotI和EcoRI酶切位点。04F(SEQ 10勵：1所示）和041?引物扩增，获得片段4，片段4(04;~2.81*;54431^8-81951^8)，在 5'末端和Y末端分别有EcoRI和Spel酶切位点。PCR产物获得片段经纯化试剂盒纯化 后亚克隆于pCRR2. 1-T0P0质粒（购自美国Invitrogen公司），每个片段测序确证。为制备 全长cDNA克隆，四个片段cDNA(01、02、03、04)酶切克隆到改造的pGEMR-7Zf[-]质粒。每 一轮克隆，克隆到质粒片段DNA测序，且和下一个片段酶连，最后的全长克隆测序确证后， 命名为 pGEM-FLOSFS。
[0072] 1.3体外RNA合成
[0073] pGEM-FLOSFS作为模板，使用OlF和04R引物扩增产生8. 2kb产物，经试剂盒（购 自德国Qiagen公司）纯化，酶切检测并测序。以上述产物作模板，采用MEGAScriptT7试剂 盒（购自美国Ambion公司），按说明书操作进行体外转录。全长转录体用氯化锂沉淀除去 自由核苷酸，用glyoxal (乙二醛）变性，在1%琼脂糖上电泳，甲苯胺蓝（toluidine blue) 染色并用紫外分光光度计定量。
[0074] 1. 4转染和恢复重组病毒
[0075] 2mL BHK-21 细胞（2X105cells/孔）接种6孔板，在37°C、5%C02过夜培养使80% 铺满，含5 μ g体外转录子和脂质体（Iipofectamine) 2000 (购自美国Invitrogen公司）混 合，按厂商提供说明书转染细胞。同时单独用Iipofectamine和p-OSFS的RNeasy试剂盒 (购自德国Qiagen公司）提取RNA与Iipofectamine混合转染BHK-21细胞作为阴性、阳 性对照。细胞暴露在Iipofectamine和RNA 2小时后，用病毒维持液洗涤单层细胞，加入新 鲜培养液37°C、5% CO2培养48小时。细胞分别在培养24、48h观察病变效应（CPE)。在48 小时后收获病毒液，冻融后在BHK-21细胞连续传代三次。质粒pGEM-FLOSFS和p-OSFS的 病毒液包含重组病毒，贮存于-80 °C备用。
[0076] 1. 4. Ir-OSFS病毒灭活和纯化
[0077] BHK-21细胞用上述方法培养成单层，用重组病毒r-〇SFS和p-OSFS以感染复数 (Multiplicity of infection，M0I) = 1.0分别感染细胞，37°C培养48h后，收集细胞培养 液，经裂解、澄清后用2倍体积双乙酰亚胺（Binary ethyleneimine，BEI)灭活。进行灭活 曲线和残余毒力试验。灭活后的抗原经超滤浓缩配制疫苗。
[0078] 灭活后FMDV抗原沉降系数（146S)检测采用：50% v/v饱和硫酸铵溶液（4M)加 入澄清培养上清液4°C过夜，4°C以2000rpm离心30min，沉淀用0. 04M磷酸缓冲液重悬，再 4°C 1000 Orpm离心60min，上清285000g超速离心2h。沉淀小心溶于0. 04M磷酸缓冲液，上 样20-40%蔗糖梯度液垫层，4°C 40000rpm超离2h。用密度梯度折射仪（购自美国Isco公 司）测定蔗糖密度，收集病毒峰，在分光光度计254nm处测定含量，纯化的146S抗原贮存于 液氮备用。
[0079] L 5重组r-〇SFS的性质和特征
[0080] 1.5. 1免疫荧光电镜
[0081] BHK-21单层细胞（15xl05/ml)分别感染重组病毒r-〇SFS和母本野生型病毒RNA 提取物P_〇SFS。用磷酸缓冲液（Phosphate buffered saline，PBS)接种细胞作为阴性对 照。单层细胞在感染后4h、8h、12h、16h分别用50%丙酮固定30min，PBS洗涤三次，加入含 10 %胎牛血清PBS稀释的特异性单克隆抗体和0. 005% Tween-20 (PBS - FBS - T)，37°C孵育 lh，移去缓冲液，用含0. 005 % Tween-20 (PBS - T)洗涤三次，加入PBS-FBS-T I :2000稀释 荧光异硫酸丙酯结合的（Ig)G，如上述孵育，用PBS洗涤。在荧光显微镜下观察。
[0082] 1. 5. 2微量中和试验
[0083] r-〇SFS和p-OSFS用p-OSFS疫苗免疫血清进行中和，t-test进行显著性检验。
[0084] I. 5. 3RT-PCR 分析
[0085] 病毒收获液是否含FMDV用血清特异性引物进行逆转录（RT) -PCR。
[0086] 1. 5. 4病毒分型和基因标记分析
[0087] FMDV血清型采用兔、豚鼠抗0型、兔抗A型、兔抗亚IFMDV多克隆抗体，进行抗原 ELISA检测。cDNA克隆上修饰改造的NheI限制性酶切位点可区别r-〇SFS和p-〇SFS。r-〇SFS 和p-OSFS转染24小时后上清分别用RNeasy微小试剂盒（购自德国Qiagen公司）提取分 离RNA，用NlF和NlR引物进行cDNA扩增，获得350nt片段克隆到pCRR2. 1-T0P质粒（购 自Invitrogen公司），测序和NheI、EcoRI酶切确定NheI酶切位点。EcoRI在插入片段的 一侧。
[0088] I. 6· 5病毒滴定和血清学
[0089] 采用ΒΗΚ-21噬斑法确定重组病毒r-〇SFS的滴度。血清中和抗体用病毒中和试验 和抗原ELISA进行。中和试验时采用平底细胞培养微滴板（购自美国Nunc公司）。抗体滴 度用中和100TCID50病毒50%的抗体最高稀释度的倒数表示。FMDV非结构蛋白3ABC抗体 用商用试剂盒（Ceditest FMDV-NS, Cedi-diagnostics)和自身发展的间接ELISA检测。
[0090] 1. 6. 6 电镜
[0091] 纯化的r-〇SFS (200 μ g/ml)吸附到碳化网格上，用1 %磷钨酸（PTA，pH 7. 0,购自 美国Sigma公司）负染，在高分辨率透射电镜（日本Hitachi H 7500)放大40000X观察。
[0092] 2.结果
[0093] 2. IcDNA克隆的组装
[0094] FMDV p-OSFS全长RNA基因组的四个cDNA片段扩增、克隆到TOPO质粒形成 ρΤΟΡΟ-ΟΙ、ρ??ΡΟ-02、ρ??ΡΟ-03、ρ??ΡΟ-04)，用表1的限制性酶分别消化，连入改造修饰质 粒 pGEMR-7Zf(-)。带有 5' poly[C]、3' poly[A]的 p-OSFS 序列同源性大于 99%。以 pGEM-FLOSFS为模板，T