上样完毕后，用洗脱缓冲液洗脱（10mm〇l/L Tris-HCl缓冲液，pH 8. 5)，调 节栗流速为l〇ml/min，根据UV值的变化收集目的峰。
[0144] 凝胶过滤层析（HR16/70层析柱Sephacryl S-100HR填料）具体实施步骤为：
[0145] 平衡：设置检测波长280nm，用Tris-HCl缓冲液（10mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8. 5)平衡5-10个柱体积，平衡时栗流速为1. 0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
[0146] 上样：将阳离子交换纯化后目的蛋白直接上样，上样时栗流速为l.Oml/min，样品 上样量为柱体积的2%。；
[0147] 洗脱：上样完毕后，用Tris-HCl液洗脱（10mm〇l/L Tris-HCl缓冲液，pH 8. 5)，调 节栗流速为1. 〇ml/min，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。
[0148] 实施例9
[0149] 阴离子柱层析（XK50/30层析柱，Q sepharose FF填料）步骤为：
[0150] 使用平衡缓冲液（20臟〇1/1口118.2 1^8-11(：1缓冲液），调节栗流速为30.01111/ min，平衡8倍柱床体积；
[0151] 样品预处理：将复性产物用2mol/L pH8. 2 Tris-HCl调其pH值为8. 2,然后超滤 浓缩至复性体积的1/10,即为上样液；
[0152] 上样：上样时栗流速为8. Oml/min。上样结束后用平衡缓冲液平衡3个柱床体积；
[0153] 洗脱：使用预洗液（20mmol/L pH7. 8 NaH2P04-Na2HP04缓冲液）进行预 洗，调节栗流速为30.0 ml/min，洗脱2个柱床体积，将进液管换至洗脱液（20mmol/ LpH7. 8NaH2P04-Na2HP04缓冲液、0. lMNaCL)中，开始目标峰洗脱，收集0D280大于0. 3洗脱 峰；
[0154] 阳离子柱层析（XK50/30层析柱，CM Sepharose FF填料）步骤为：
[0155] 平衡：使用平衡缓冲液（20mmol/L pH4. 5 HAc-NaAc缓冲液），调节栗流速49. 9ml/ min，平衡9倍柱床体积；
[0156]上样：上样液为上步得到的0D280大于0. 3的洗脱液，调节栗流速30. 0-49. 9ml/ min，开始上样，上样结束后，换至平衡缓冲液中，平衡4个柱床体积，至记录笔回至基线，用 预洗液（20mmol/L pH4. 5HAc-NaAc缓冲液、0. 15MNaCL缓冲液）进行预洗，调节栗流速为 30. 0ml/min，至杂质峰洗下为止，换至洗脱液（50mmol/L pH4. 5HAc_NaAc缓冲液、0. 2MNaCL 缓冲液）进行洗脱目的峰，收集0D280大于0. 3的洗脱峰。
[0157] 反相填料层析
[0158]采用Pharmacia公司的预装型SOURCE 5RPC 4. 6/150柱（粒径5 ym，4.6 X 150mm、 柱温度2-6 °C，流速1.0ml/min)。配制洗脱液A为含lOOmmolNaCl溶液lOmmol pH = 8. OTris-HCl缓冲液，洗脱液B为含100mmolNaCl、50%乙腈的lOmmol pH = 8. 0 Tris-HCl 缓冲液。先用洗脱液A洗脱；再用梯度20% -80%洗脱液B洗脱，15-35分钟收集样品峰。 被收集的样品经低温蒸发，除去有机物质，然后透析浓缩后保存在2-8°C条件下。
[0159] 表1实施例组各项指标考察结果
[0160]
[0161] 表1表明，只有实施例1的纯度和活性最好，为理想的纯化方法，蛋白纯度达到 99. 8%，比活性为1. 5X10sIU/mg，具有进一步的开发价值。
[0162] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种重组粒细胞集落刺激因子多肽的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 选用PPIC9K-G-CSF15-75-GS115工程菌做菌株进行发酵培养； 2) 发酵培养液12000rpm，离心10min，上清液过0. 45 y m滤膜； 3) 对过滤上清进行疏水层析纯化处理，得到疏水层析产物； 4) 对疏水层析产物阴离子交换，得到阴离子交换液； 5) 对阴离子交换液进行凝胶过滤，得到重组人粒细胞集落刺激因子多肽。2. 如权利要1所述的重组粒细胞集落刺激因子多肽的纯化方法，其特征在于，所述的 工程菌为保藏号为CGMCC NO: 10713的巴斯德毕赤酵母菌。3. 如权利要1所述的重组粒细胞集落刺激因子多肽的纯化方法，其特征在于步骤3)所 述的疏水层析柱填料为Phenyl Sepharose 6 Fast Flow high sub，具体实施步骤为： 样品预处理：接收步骤2)所得过滤后的发酵上清液，用乙酸调pH至5. 0,加固体NaCl 调节 cd 至 50ms/cm ; 平衡：设置检测波长280nm，用平衡缓冲液平衡5-10倍柱体积，平衡时栗流速为 20.0 ml/min，待UV值稳定后，紫外校零； 上样：上样时栗流速为8. 0-18. 5ml/min，上样结束后用平衡缓冲液复平衡5个柱床体 积； 洗脱：上样完毕后，用洗脱缓冲液洗脱，调节栗流速为5. 5-10. 2ml/min，根据UV值的变 化收集主峰。4. 如权利要3所所述的重组粒细胞集落刺激因子多肽的纯化方法，其特征在于，所述 的平衡缓冲液为lOmmol/L HAc-NaAc，pH 5. 0,加固体NaCl调节cd 50ms/cm;所述的洗脱缓 冲液为 lOmmol/L Tris-HCl，pH 8. 5。5. 权利要1所述的重组粒细胞集落刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述的 步骤4)阴离子交换其柱填料为聚苯乙烯-二乙烯苯SKI-10层析柱，具体实施步骤为： 样品预处理：接收步骤3)所得疏水层析后蛋白溶液，用氢氧化钠调pH至8. 5,加水稀 释至 cd 为 l_4ms/cm ; 平衡：设置检测波长280nm，用平衡缓冲液平衡5-10倍柱体积，平衡时栗流速为 20. 0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零； 上样：将疏水层析峰直接上样，上样时栗流速为8. 5-19. 8ml/min，上样结束后用平衡 缓冲液复平衡5个柱床体积； 洗脱：上样完毕后，用洗脱缓冲液洗脱，调节栗流速为5. 5-10. 2ml/min，根据UV值的变 化收集目的峰。6. 如权利要5所述的重组粒细胞集落刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述的平衡 缓冲液为 lOmmol/L Tris-HCl，pH 8.5 ;所述的洗脱缓冲液为 lOOmmol/L HAc-NaAc，pH 5.0〇7. 如权利要1所述的重组粒细胞集落刺激因子多肽的纯化方法，其特征在于，所述的 步骤5)凝胶过滤柱填料为Sephacryl S-100HR，具体操作步骤为： 平衡：设置检测波长280nm，用HAc-NaAc缓冲液平衡5-10个柱体积，平衡时栗流速为 0. 3-1. 17ml/min，待UV值稳定后，紫外校零； 上样：将阴离子交换纯化后目的蛋白直接上样，上样时栗流速为〇. 3-1. 17ml/min，样 品上样量为柱体积的〇. 5 % -4 % ; 洗脱：上样完毕后，用HAc-NaAc缓冲液洗脱，调节栗流速为0. 3-1. 17ml/min，根据UV 值的变化收集目的蛋白溶液。8.如权利要7所述的重组粒细胞集落刺激因子多肽的纯化方法，其特征在于，所述的 HAc-NaAc 缓冲液为 10mmol/],HAc-NaAc，pH 5. 0。
【专利摘要】本发明涉及一种重组人粒细胞刺激因子多肽的纯化方法，该方法包括以下步骤：选用pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115工程菌做菌株进行发酵培养；发酵培养液12000rpm，离心10min，上清液过0.45μm滤膜；对过滤后上清进行疏水层析纯化处理，得到疏水层析产物；对疏水层析产物进行阴离子交换和凝胶过滤，最后所得的G-CSF(15-75)的纯度达到99％以上，比活性达到了1.5×108IU/mg，为G-CSF(15-75)的工业化大生产奠定基础。CGMCC No.1071320150413
【IPC分类】C07K1/18, C07K1/20, C12R1/84, C07K1/16, C12P21/02
【公开号】CN105039472
【申请号】CN201510306601
【发明人】张贵民, 朱中松, 金艳彩
【申请人】山东新时代药业有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月6日